梨采后病害拮抗菌的分離與篩選

張曉宇，張則君，韓巨才

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮研究所，山西太原030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

梨采后貯藏期和貨架期易被病害侵染，果肉易軟化腐爛，對(duì)貯藏保鮮造成很大困難，給果農(nóng)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著社會(huì)的發(fā)展，人們對(duì)果蔬質(zhì)量的要求不斷提高，環(huán)保意識(shí)不斷加強(qiáng)，迫切需要新的安全有效的方法來(lái)控制果蔬的采后病害。由于生物抑菌劑防病效果明顯、無(wú)毒，且成本低，成為果蔬保鮮的重要發(fā)展方向，也是減少化學(xué)藥劑使用量的有效途徑[1]。

對(duì)梨采后病害的拮抗菌研究始于20世紀(jì)80年代，Chand 等[2]和 Sugar等[3]分別發(fā)現(xiàn)了 Cryptococcus albidus和Cryptococcus infirmominiatus，用于抑制青霉菌（Penicillium expansum）；Janisiewicz等[4]和 Lima等[5]分別發(fā)現(xiàn)了Pseudomonas syringae和Rhodotorula glutinis，用于抑制灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）；謝莉[6]和齊冬梅等[7]分別發(fā)現(xiàn)了Streptomyces aureus和Bacillus subtilis，用于抑制鏈格孢菌（Alternaria alternata）。用于生物防治的拮抗菌涵蓋了細(xì)菌、酵母菌和放線(xiàn)菌，充分說(shuō)明生防菌具有巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

本試驗(yàn)從各種水果和葉片表面進(jìn)行拮抗菌的分離，篩選出對(duì)梨采后致病菌有拮抗作用的細(xì)菌，旨在為探索新的梨采后病害防治途徑提供一定理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 梨、杏、西梅、黑李、冬棗、葡萄、山楂、桃無(wú)病蟲(chóng)害及機(jī)械損傷的果實(shí)和葉片 梨采自山西省清徐縣高花鄉(xiāng)高花村，杏采自山西省大同市陽(yáng)高縣，西梅、黑李、桃均采自山西省太原市金灘村，山楂分別采自山西省太原市金灘村和山西省太谷縣，冬棗采自山東省沾化縣，葡萄采自山西省清徐縣。試材于2011年8—9月采回，當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，裝袋后存放于冰箱。

1.1.2 供試病原菌 梨鏈格孢菌（Alternaria alternata）、梨鐮刀菌（Fusarlum poae）、梨毛霉菌（Mucoraceae racemosus）均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮研究所采后病理研究室分離保存。將病原菌在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)7～14 d，用無(wú)菌水制成孢子懸浮液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)配濃度為1×104個(gè)孢子/mL。

1.1.3 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨（NA）培養(yǎng)基：牛肉膏為 5 g，蛋白胨為10 g，NaCl為 5 g，瓊脂粉為10 g，水1 000 mL，pH值7.2；酵母膏蛋白胨（LA）培養(yǎng)基：酵母膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，瓊脂粉 10 g，水1 000 mL，pH 值 7.4；馬鈴薯（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 10 g，水 1 000 mL，pH值為6.5～7.0。

1.2 拮抗菌的分離

分別取梨、梨葉、杏、杏葉、西梅、黑李、冬棗、葡萄、葡萄葉、山楂、山楂葉、桃、桃葉放入燒杯中，使用0.05 mL/L的磷酸緩沖液（pH值為6.5）沖洗2次，第1次在搖床100 r/min旋轉(zhuǎn)振蕩器中洗滌10 min，保留洗液；第2次用超聲沖洗10 min，保留洗液。

取無(wú)病無(wú)傷、大小和成熟度相似的梨果，用2%的次氯酸鈉溶液表面消毒后，自然晾干。在梨果上用接種針挖3 mm×3 mm的孔，每個(gè)孔注入2次的洗液各20 μL，待晾干后再注入病原菌孢子懸浮液20 μL（1×104個(gè)孢子 /mL）。晾干后將梨果裝入塑料筐內(nèi)，套保鮮袋，扎口，保持濕度在95%左右，室溫下7 d后檢查。選取未發(fā)病，且傷口處長(zhǎng)有拮抗菌菌落形態(tài)的梨果，用無(wú)菌接種針刮取菌落表層，在研缽中研碎。用0.05 mL/L的磷酸緩沖液（pH值為6.5）定容4 mL，分別稀釋10倍和100倍。分別取此稀釋后的懸浮液各100 mL，用涂布器分別涂在NA，LA培養(yǎng)基上。培養(yǎng)48 h后，把具有不同形態(tài)特征的單一菌落分別在NA，LA培養(yǎng)基平皿上劃線(xiàn)，挑取純化后的單菌落，用小試管斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 拮抗菌的篩選

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法[8]，處理用直徑1 cm的打孔器取病原菌菌塊放于PDA平板中央，在距其2.5 cm的地方用無(wú)菌接種針各沾一環(huán)單菌落劃一條線(xiàn)，同時(shí)以不劃線(xiàn)直接病原菌菌塊為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。培養(yǎng)4～6 d后，觀察不同菌株是否對(duì)病原菌有抑制生長(zhǎng)的作用及測(cè)量抑菌圈的大小。按照抑菌半徑的大小，將拮抗菌的拮抗作用分為強(qiáng)、中、弱3類(lèi)。

2 結(jié)果與分析

結(jié)果表明，從梨果表面共獲得細(xì)菌分離物89株，再經(jīng)過(guò)篩選試驗(yàn)得到以下結(jié)果。

2.1 拮抗細(xì)菌對(duì)植物病原真菌的抑制作用

以梨鏈格孢菌（Alternaria alternata）、梨鐮刀菌（Fusarlum poae）、梨毛霉菌（Mucoraceae racemosus）為靶標(biāo)菌，用平板對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)試了89株菌對(duì)病原真菌的拮抗作用，結(jié)果表明，有5株細(xì)菌菌株對(duì)3種病原真菌均具有較強(qiáng)的拮抗作用，占篩選到菌株總數(shù)的5.6%。

從表1可以看出，拮抗細(xì)菌菌株可以分為3類(lèi)：HM3和XM2除菌落大小不同外，具有相似的菌落形態(tài)特征；XY1區(qū)別于其他菌株的最大特點(diǎn)是其呈黃綠色透明狀；HJL6和L4具有相似的菌落形態(tài)特征。

表1 拮抗細(xì)菌菌落的形態(tài)特征

2.2 細(xì)菌對(duì)梨鏈格孢菌的抑制作用

通過(guò)對(duì)89株細(xì)菌菌株進(jìn)行生長(zhǎng)對(duì)峙試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有10株菌對(duì)梨鏈格孢菌的生長(zhǎng)有抑制作用，占到菌株總數(shù)的11.2%；對(duì)梨鏈格孢菌有較強(qiáng)抑菌作用的菌株是 HM3，HM2，XM2，XY1，TYSZ6，PT4；對(duì)梨鏈格孢菌抑菌作用較弱的菌株是HJL6，HJL4，L4，DZ2；其余菌株對(duì)梨鏈格孢菌無(wú)拮抗作用。其中，HM3和HM2的抑菌效果最為明顯，其抑菌率達(dá)到95%以上（表2）。

表2 細(xì)菌對(duì)梨鏈格孢菌的抑制效果

2.3 細(xì)菌對(duì)梨鐮刀菌的抑制作用

通過(guò)對(duì)89株細(xì)菌菌株進(jìn)行生長(zhǎng)對(duì)峙試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有15個(gè)菌對(duì)梨鐮刀菌的生長(zhǎng)有抑制作用，占菌株總數(shù)的16.9%，其中，有較強(qiáng)抑菌作用的菌株 是 HJL6，L4，HM3，HM2，XY1，DZ2，TYSZ6，PT4，SL2，抑菌作用較弱的菌株是 XM2，HJL4，HJL5，XM1，HM4，DZ1，其余菌株無(wú)拮抗作用。其中，HJL6，HM2和XY1的抑菌效果最為明顯，其抑菌率達(dá)到95%以上（表3）。

表3 細(xì)菌對(duì)梨鐮刀菌的抑制效果

2.4 細(xì)菌對(duì)梨毛霉菌的抑制作用

通過(guò)對(duì)89株細(xì)菌菌株進(jìn)行生長(zhǎng)對(duì)峙試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有11個(gè)菌株對(duì)梨毛霉菌的生長(zhǎng)有抑制作用，占菌株總數(shù)的12.4%，有較強(qiáng)抑菌作用的菌株是 HJL4，XM2，HM3，L4，XY1，TYSZ6，抑菌作用較弱的菌株是 XM1，SZY3，TYSZ7，TGSZ2，TY3，其余菌株無(wú)拮抗作用。其中，HJL4和XM2的抑菌效果最為明顯，其抑菌率達(dá)到95%以上（表4）。

表4 細(xì)菌對(duì)梨毛霉菌的抑制效果

3 結(jié)論與討論

根據(jù)本試驗(yàn)篩選的有拮抗作用的細(xì)菌形態(tài)特征初步推知，拮抗細(xì)菌的菌落形態(tài)各異，拮抗能力與菌落形態(tài)并不存在必然聯(lián)系。另外，大量的研究表明[9-13]，離體（in vitro）條件下和活體（in vivo）條件下的拮抗能力不一定一致，不存在相關(guān)性，不能根據(jù)一個(gè)方面的抗病能力就淘汰或肯定一株細(xì)菌。

本試驗(yàn)得到的HM3和XY1這2株細(xì)菌對(duì)梨鏈格孢菌（Alternaria alternata）、梨鐮刀菌（Fusarlum poae）、梨毛霉菌（Mucoraceae racemosus）3 種致病菌均有顯著抑菌效果，還有待于對(duì)其進(jìn)行生理生化和分子生物學(xué)鑒定，并對(duì)其進(jìn)行抑菌譜的測(cè)定，以便為梨采后病害生物防治提供理論依據(jù)。

[1]范青，田世平，徐勇，等.季也蒙假絲酵母對(duì)采后桃果實(shí)軟腐病的抑制效果[J].植物學(xué)報(bào)，2000，42（10）：1033-1038.

[2]Chand-Goyal T，Spotts R A.Control of postharvest pear diseases using natural saprophytic yeast colonists and their combination with a low dosage of thiabendazole[J].Postharvest Biol Technol，1996，7：51-64.

[3]Sugar D，Spotts R A.Control of postharvest decay in pear by four laboratory-grown yeasts and tworegistered biocontrol products[J].Plant Dis，1999，83：155-158.

[4]Janisiewicz W J，Marchi A.Control of storage rots on various pear cultivars with a saprophytic strain of Pseudomonas syringe[J].Plant Dis，1992，76：555-560.

[5]Lima G，De-Curtis F，Castoria R，et al.Activity of the yeast Cryptoccus laurentii and Rhodotorula glutinis against postharvest rots on different fruits[J].Biocontrol Science and Technology，1998，8：257-267.

[6]謝莉.梨黑斑病拮抗放線(xiàn)菌的選育及其抗菌物質(zhì)研究[D].石家莊：河北師范大學(xué)，2008.

[7]齊東梅，惠明，梁?jiǎn)⒚溃?枯草芽孢桿菌H110對(duì)蘋(píng)果梨采后青霉病和黑斑病的抑制效果[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2005，11（2）：171-174.

[8]李麗霞，夏明聰，孔景萍.拮抗菌對(duì)土傳病害防治效果的初步研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（3）：54-55.

[9]范青.果實(shí)采后病害生物防治及其機(jī)理研究[D].北京：中國(guó)科學(xué)院植物研究所，2001.

[10]Anisiewicz W J，Tworkoski T J，Sharer C.Characterizing the mechanism of biological control of postharvest diseases on fruits with a simple method to study competition for nutrients[J].Phytopathology，2000，90（11）：1196-1200.

[11]高芬，馬利平，喬雄梧.對(duì)番茄早疫病拮抗菌的篩選[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001，29（3）：64-66.

[12]程根武，王勇，楊秀榮，等.拮抗酵母菌用于產(chǎn)后病害生物防治的研究進(jìn)展[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，8（1）：44-46.

[13]馬利平，喬雄梧，高芬，等.B96-11對(duì)3種枯萎病的防治效果及拮抗物質(zhì)初步分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2006，21（4）：99-102.