石灰性土壤中高效磷細(xì)菌群解磷動(dòng)力學(xué)研究

張 健，洪堅(jiān)平

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，山西太谷030801）

除了施用化學(xué)磷肥以外，施用能夠分解土壤中難溶態(tài)磷的解磷細(xì)菌肥料，使其在作物根際形成一個(gè)磷素供應(yīng)較充分的微區(qū)[2]，從而改善作物磷素營(yíng)養(yǎng)，提高作物的生物量和產(chǎn)量[3]，也是一個(gè)重要途徑。而微生物肥料或菌劑能使失去微生物活性的土壤重新建立和恢復(fù)土壤微生物體系[4-5]，開(kāi)展解磷高效微生物的研究與應(yīng)用，對(duì)于挖掘土壤磷資源的利用潛力、節(jié)約磷肥投入、降低生產(chǎn)成本、保護(hù)我國(guó)磷礦資源和農(nóng)業(yè)高效持續(xù)發(fā)展具有重要的理論意義和實(shí)踐意義[6]。

磷細(xì)菌的解磷變量是在活細(xì)胞的作用下變化的，動(dòng)力學(xué)要研究這種變化規(guī)律以及各種條件對(duì)這些變量變化速度的影響以及影響其速率的各種因素，從而獲得相關(guān)信息，可反映細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境變化的能力[7]。這一研究有助于我們更加深入地認(rèn)識(shí)和掌握磷細(xì)菌菌肥對(duì)活化土壤、增加磷營(yíng)養(yǎng)的可給性方面的研究[8]。磷細(xì)菌單菌株的解溶磷效果比較單一，而且效果相對(duì)有限，但目前，磷細(xì)菌群的研究相對(duì)較少。

本試驗(yàn)將從石灰性土壤中分離鑒定出的5種磷細(xì)菌進(jìn)行組建，通過(guò)建立化學(xué)動(dòng)力學(xué)方程對(duì)組建的解磷菌群進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究，從而得到不同磷細(xì)菌群解磷動(dòng)力學(xué)曲線和動(dòng)力學(xué)方程，旨在為磷細(xì)菌生物肥料更好地被應(yīng)用于生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)所用菌株為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室從石灰性土壤中分離鑒定出的5種磷細(xì)菌，即有機(jī)磷細(xì)菌：蠟狀芽孢桿菌（B.cereus）、巨大芽孢桿菌（有機(jī)）（Bacillus megaterium）、黃桿菌（Flavobacterium）；無(wú)機(jī)磷細(xì)菌：假單胞菌（Pseudomonas）、巨大芽孢桿菌（無(wú)機(jī)）（Bacillus megaterium）。

1.2 菌株培養(yǎng)基[8]

無(wú)機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基：葡萄糖10g，（NH4）2SO40.5g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·g，蒸餾水1 000 mL。

有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，蒸餾水1 000 mL，蛋黃液30 mL（無(wú)菌生理鹽水與雞蛋黃1∶1配制），調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)菌種類型組建的6個(gè)磷細(xì)菌群分別為：G1.蠟狀芽孢桿菌＋巨大芽孢桿菌（無(wú)機(jī)）），G2.蠟狀芽孢桿菌＋假單胞菌；G3.黃桿菌＋巨大芽孢桿菌（無(wú)機(jī)）；G4.黃桿菌＋假單胞菌；G5.巨大芽孢桿菌（有機(jī)）＋巨大芽孢桿菌（無(wú)機(jī)）；G6.巨大芽孢桿菌（有機(jī)）＋假單胞菌。

2008年9月底的一天，有個(gè)客戶開(kāi)了一輛銀灰色的凱迪拉克駛?cè)霃S區(qū)，正值下班時(shí)間，許多人都駐足觀看，就連平素高傲的副總裁的女兒方勛梅也發(fā)出了一聲贊嘆：“哇，凱迪拉克！”程曉暗戀方勛梅由來(lái)已久，只因門戶懸殊，他只有將自己的白日夢(mèng)安放在姥姥家了?，F(xiàn)在聽(tīng)到方勛梅對(duì)凱迪拉克如此景仰，程曉的心久久不能平靜。他在網(wǎng)絡(luò)上把能讓方勛梅發(fā)出驚嘆的那輛凱迪拉克型號(hào)搜索了出來(lái)：它線條俊朗剛毅，身姿優(yōu)雅華貴，顏色明麗誘人，是凱迪拉克3.6L運(yùn)動(dòng)型，報(bào)價(jià)68.86萬(wàn)元!

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 不同磷細(xì)菌群解磷動(dòng)力學(xué)曲線的建立 將50 mL培養(yǎng)基（有機(jī)磷細(xì)菌和無(wú)機(jī)磷細(xì)菌各25 mL）裝入100 mL三角瓶中，加0.5 g磷礦粉，每瓶接磷菌群1 mL，共16瓶，30℃搖床培養(yǎng)。每隔24 h隨機(jī)取出2瓶，共培養(yǎng)8 d，分別取菌液測(cè)定速效磷含量和活菌數(shù)量，測(cè)定結(jié)果取其平均值。

1.4.2 不同磷礦粉量對(duì)磷細(xì)菌群轉(zhuǎn)化有效磷的影響 將50 mL培養(yǎng)基（有機(jī)磷細(xì)菌和無(wú)機(jī)磷細(xì)菌各25 mL）裝入100 mL三角瓶中，分別加入0.063，0.125，0.250，0.500，1.000，2.000 g 磷礦粉，30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)，5 d后取出，測(cè)定菌液速效磷含量，測(cè)定結(jié)果取其平均值。同時(shí)以未接菌的含磷礦粉培養(yǎng)基為空白對(duì)照（CK）。

1.5 測(cè)定項(xiàng)目及方法

有效磷的測(cè)定采用鉬藍(lán)比色法[9-10]；全磷的測(cè)定采用H2SO4-HClO4消煮鉬藍(lán)比色法[9]；細(xì)菌菌數(shù)的測(cè)定采用平板計(jì)數(shù)法[10]；磷細(xì)菌群解磷動(dòng)力學(xué)方程的建立，采用Monod方程的非結(jié)構(gòu)模型和發(fā)酵動(dòng)力學(xué)中的生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型模型及其數(shù)學(xué)擬合法[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同磷細(xì)菌群解磷動(dòng)力學(xué)曲線的建立

以時(shí)間為橫坐標(biāo)、有效磷量為縱坐標(biāo)，得到各個(gè)解磷菌群解磷動(dòng)力學(xué)曲線如圖1所示。其反映了各菌群的解磷能力對(duì)時(shí)間的依賴關(guān)系。由圖1可知，隨著解磷時(shí)間的延長(zhǎng)，所有磷細(xì)菌群處理下的有效磷數(shù)量不斷增加，尤其在前5 d，增加率較大，5 d后增加率趨于平緩。這可能是由于菌體將部分無(wú)機(jī)磷轉(zhuǎn)化為菌體中的結(jié)構(gòu)磷所致。鄭傳進(jìn)[11]研究得出，巨大芽胞桿菌對(duì)無(wú)機(jī)磷中磷的釋放在第5天和第7天達(dá)到最大值，以后漸達(dá)平衡。G3（黃桿菌＋巨大芽孢桿菌（無(wú)機(jī)））的解磷能力相對(duì)其他菌群處理較高，是本試驗(yàn)所需的最佳組合，說(shuō)明黃桿菌和巨大芽孢桿菌（無(wú)機(jī)）有較好的協(xié)同作用，這是由于5 d后巨大芽孢桿菌解磷能力下降，而黃桿菌的解磷能力沒(méi)有明顯下降[3]，所以，這2種解磷菌在發(fā)揮最大解磷能力的時(shí)間上互相補(bǔ)充，并且巨大芽孢桿菌和黃桿菌所釋放的磷酸酶和有機(jī)酸能互相協(xié)同螯合金屬離子，使難溶磷溶解出來(lái)[12]。

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)不同磷菌群活菌數(shù)的影響

從表1可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各解磷菌群處理的活菌數(shù)均有所增加，其中，G3處理的活菌數(shù)增加最快，G2，G5處理次之。

表1 不同處理的磷細(xì)菌活菌數(shù) ×107個(gè)/mL

各菌群隨時(shí)間變化的磷細(xì)菌數(shù)量和有效磷形成量如圖2所示。

從圖2可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，磷細(xì)菌群菌體生長(zhǎng)量與有效磷的產(chǎn)生量呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性，即有效磷與菌群活菌數(shù)均隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而有所增加。

對(duì)于磷細(xì)菌來(lái)說(shuō)，提高解溶磷的效果，最主要是通過(guò)增加磷細(xì)菌的數(shù)量來(lái)實(shí)現(xiàn)。磷細(xì)菌生物肥料含菌數(shù)一般為108～109個(gè)/g菌肥，通過(guò)施用磷細(xì)菌菌肥可增加土壤內(nèi)磷細(xì)菌數(shù)量，實(shí)現(xiàn)土壤有效磷增加的目的。另外，使得磷細(xì)菌獲得較高的生長(zhǎng)速率也是增加磷細(xì)菌數(shù)量的有效途徑，也可以達(dá)到提高磷溶解速度的目的。Breet等[13]研究指出，植物和細(xì)菌的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)相互關(guān)聯(lián)，因?yàn)樗麄兊纳L(zhǎng)被同一種營(yíng)養(yǎng)源限制，主要是有效磷。從圖2還可以看出，培養(yǎng)初期，磷細(xì)菌剛接種到培養(yǎng)基中，處于適應(yīng)期，此時(shí)有少量有效磷存在（這些磷源可供磷細(xì)菌生長(zhǎng)）；適應(yīng)期過(guò)后，磷細(xì)菌快速生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并在其生長(zhǎng)代謝過(guò)程中迅速將無(wú)效磷轉(zhuǎn)化為有效磷；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，有效磷的含量也逐漸升高；培養(yǎng)中期磷細(xì)菌進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，活菌數(shù)增長(zhǎng)比較緩慢；到培養(yǎng)后期，磷細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期，活菌數(shù)急劇下降，有效磷的含量穩(wěn)定在一定的水平。劉麗麗[14]研究指出，當(dāng)磷細(xì)菌生物肥施入田間時(shí)，在磷細(xì)菌和植物根系形成的微生態(tài)中，植物根部的脫落物和分泌物不斷地向磷細(xì)菌提供營(yíng)養(yǎng)，加速其生長(zhǎng)，而解磷反應(yīng)的產(chǎn)物不斷地被植物吸收，根際微生態(tài)中的溶磷動(dòng)力學(xué)的平衡點(diǎn)向形成產(chǎn)物的方向移動(dòng)，從而刺激植物快速生長(zhǎng)。微生物生態(tài)學(xué)家認(rèn)為，土壤內(nèi)的微生物一般來(lái)說(shuō)是處于饑餓狀態(tài)，外界提供營(yíng)養(yǎng)的情況會(huì)很大程度上影響微生物的生長(zhǎng)，所以，當(dāng)磷細(xì)菌生物肥料中磷細(xì)菌在植物根部定植下來(lái)以后，對(duì)磷細(xì)菌來(lái)說(shuō)植物提供的營(yíng)養(yǎng)條件是限制其生長(zhǎng)的主要因素[15-16]。

2.3 不同磷細(xì)菌群解磷動(dòng)力學(xué)方程的建立

從表2可以看出，隨著提供的底物磷礦粉量的增多，不同磷細(xì)菌群轉(zhuǎn)化有效磷的數(shù)量在增加。說(shuō)明在一定的范圍內(nèi)，提供的底物磷礦粉越多，磷細(xì)菌群轉(zhuǎn)化有效磷的數(shù)量就越多。以磷礦粉量為橫坐標(biāo)，以培養(yǎng)液中的有效磷量為縱坐標(biāo)，可得到菌群的無(wú)效磷轉(zhuǎn)化曲線，以G1為例，如圖3（曲線A）所示。

表2 不同磷礦粉量對(duì)磷細(xì)菌群轉(zhuǎn)化有效磷的影響 mg/L

由無(wú)效磷轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)曲線（圖3）得到動(dòng)力學(xué)方程:

式中，Y為有效磷量，X為細(xì)菌濃度，a為轉(zhuǎn)化常數(shù)，b為特征常數(shù)。

由（1）得：11.83＝alg1＋b

由（2）得到：a＝4.74，b＝11.83。

即G1的無(wú)效磷轉(zhuǎn)化有效磷的動(dòng)力學(xué)方程為：

方程經(jīng)擬合驗(yàn)證：

由圖3可知，用試驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型計(jì)算值進(jìn)行驗(yàn)證比較，模型計(jì)算（曲線B）與試驗(yàn)結(jié)果（曲線A）擬合良好。

同樣方法得出，G2無(wú)效磷（磷礦粉）轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)方程為：Y＝3.7lgX＋13.65；G3無(wú)效磷（磷礦粉）轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)方程為：Y＝28.29lgX＋45.99；G4無(wú)效磷（磷礦粉）轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)方程為：Y＝9.13lgX＋18.92；G5無(wú)效磷（磷礦粉）轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)方程為：Y＝27.62lgX＋45.99；G6無(wú)效磷（磷礦粉）轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)方程為：Y＝3.39lgX＋12.40。

從6個(gè)菌群無(wú)效磷（磷礦粉）轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)方程可以看出，G3方程中轉(zhuǎn)化系數(shù)和特征常數(shù)的值最大，說(shuō)明G3（黃桿菌和巨大芽孢桿菌（無(wú)機(jī)）的組合）處理的無(wú)效磷轉(zhuǎn)化有效磷的能力最強(qiáng)。模型正確地反映了磷細(xì)菌群的產(chǎn)物形成過(guò)程及其動(dòng)力學(xué)機(jī)制[17]，說(shuō)明通過(guò)對(duì)初選出的6組高效解磷菌群進(jìn)行比較，得出黃桿菌和巨大芽胞桿菌對(duì)無(wú)效磷的轉(zhuǎn)化有很好的協(xié)同作用，這2種磷細(xì)菌相互促進(jìn)各種產(chǎn)物的形成，對(duì)有效磷的增加有很好的效果。

Sperber等[18]研究結(jié)果表明，根際微生物的活性及其群落結(jié)構(gòu)對(duì)植物磷素營(yíng)養(yǎng)影響很大，在這個(gè)過(guò)程中，磷細(xì)菌群可以將無(wú)效磷轉(zhuǎn)化為植物營(yíng)養(yǎng)磷，并且隨磷細(xì)菌數(shù)量增加而增加，隨土壤中全磷特別是無(wú)效磷（磷礦粉）量增加而增加；在施用磷細(xì)菌生物肥后，將對(duì)活化土壤、增加磷營(yíng)養(yǎng)的可給性帶來(lái)很大改善[11]；有些種類的磷細(xì)菌除了具有解磷活性，在植物根際還能夠分泌一定量的植物激素，對(duì)作物生長(zhǎng)具有刺激作用[19]。因此，大力推廣使用磷細(xì)菌生物肥料能克服大量使用化肥所帶來(lái)的環(huán)境污染問(wèn)題，并通過(guò)微生物的修復(fù)作用，可改善土壤環(huán)境、促進(jìn)持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，各磷細(xì)菌群處理下的有效磷數(shù)量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加，尤其在前5 d的增加率較大，5 d后增加率趨于平緩。在不同磷水平下，底物濃度越高，磷細(xì)菌群的轉(zhuǎn)化有效磷量越大，其中，黃桿菌和巨大芽孢桿菌（無(wú)機(jī)）組合轉(zhuǎn)化有效磷含量相對(duì)較高，無(wú)效磷（磷礦粉）轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)方程為：Y＝28.29lgX＋45.99，且在磷礦粉為2 g時(shí)，有效磷含量最高，達(dá)到50.24 mg/L。

本試驗(yàn)中的磷細(xì)菌群是由2種類型的磷細(xì)菌組成，其內(nèi)部作用機(jī)理比單菌株的解溶磷機(jī)理更為復(fù)雜，試驗(yàn)通過(guò)綜合各測(cè)定指標(biāo)得出，黃桿菌和巨大芽孢桿菌（無(wú)機(jī)）的組合有較高的生長(zhǎng)速率，對(duì)無(wú)效磷的轉(zhuǎn)化起到相對(duì)較好的作用，這為更好地研制磷細(xì)菌生物肥料提供了理論依據(jù)。

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