前列腺增生癥腎虛血瘀證大鼠動(dòng)物模型的建立與評(píng)價(jià)

樊新榮，顏 苗，何清湖

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙 410007;2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410011)

前列腺增生癥(Benign Prostatie Hyperplasia，BPH)是增生的前列腺壓迫前列腺尿道或影響膀胱尿道口梗阻，出現(xiàn)尿頻、排尿困難，甚則尿液無(wú)法排出的病癥，是中老年男性的常見(jiàn)病和多發(fā)病。中醫(yī)文獻(xiàn)中雖沒(méi)有 BPH這一名稱，但從癥狀和體征來(lái)看，BPH屬中醫(yī)學(xué)“癃閉”范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，年老體衰、腎氣虧虛是 BPH的發(fā)病基礎(chǔ)，瘀血、痰濁、濕熱是基本的內(nèi)因或病理基礎(chǔ)，勞力過(guò)度、情志刺激、外感六淫、飲食不節(jié)是常見(jiàn)的發(fā)病誘因，本虛標(biāo)實(shí)是基本病機(jī)特點(diǎn)。何清湖［1，2］通過(guò)審證求因、臨床驗(yàn)證、微觀辨證佐證3個(gè)層面探討了BPH病因病機(jī)，認(rèn)為腎虛是BPH發(fā)生的基本條件，血瘀是BPH病理改變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，腎虛和血瘀相互影響，構(gòu)成了BPH的病理機(jī)制。目前與中醫(yī)證相似的BPH動(dòng)物模型報(bào)道不多，影響著中藥療效及藥物機(jī)理的研究。本文成功建立了BPH腎虛血瘀證大鼠模型并進(jìn)行了評(píng)價(jià)，為深入探討中醫(yī)藥防治BPH的治法及作用機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康成年雄性SD大鼠共96只，體質(zhì)量在230～280g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境:室溫為23℃ ±2℃，相對(duì)濕度為60% ±10%。

1.1.2 儀器 AG204-N型電子分析天平(瑞士梅特勒-托力多有限公司);AF100型制冰機(jī)(意大利斯科茨曼公司);Dyy-Ⅲ-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京市六一儀器廠);顯微手術(shù)器械(上海手術(shù)器械公司);解剖顯微鏡(日本OLYMPUS公司);3K18型低溫離心機(jī)(德國(guó) SIGMA公司);7001×UVI型數(shù)字彩色顯微圖像分析系統(tǒng)(英國(guó)UVI公司);GC-1500r型放射免疫計(jì)數(shù)器(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司);Biofuge fresco 4℃離心機(jī)(美國(guó)SORVALL公司);RM2125石蠟切片機(jī)(德國(guó) Leica公司);MK3酶標(biāo)儀(芬蘭雷勃公司)。

1.1.3 試劑和藥物 大鼠酸性磷酸酶(ACP)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、大鼠非前列腺特異性酸性磷酸酶(NPAP)酶聯(lián)免疫分析試劑盒購(gòu)自美國(guó) R＆D公司;Trizol試劑盒購(gòu)自SIGMA公司;丙酸睪丸酮注射液(Testosterone propionate，規(guī)格 25mg×10 支/盒，批號(hào)081003)，由上海通用藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn);橄欖油(Olive oil)購(gòu)自廣州澳博貿(mào)易有限公司;前列癃閉通片(規(guī)格:0.5g×36片/盒，批號(hào)090301)，由湖南藥圣堂制藥有限公司生產(chǎn)。

1.2 模型的制備方法

本研究采用去勢(shì)手術(shù)、激素注射和冰浴方法制作BPH腎虛血瘀證大鼠模型，具體操作方法如下。

1.2.1 去勢(shì)手術(shù)操作 造模組的大鼠使用戊巴比妥鈉，按照100mg/kg體質(zhì)量的劑量，腹腔注射麻醉，5～6min后觀察鼠躺倒、肌體松軟，示麻醉成功。將麻醉成功的老鼠固定在手術(shù)臺(tái)上，陰囊皮膚常規(guī)消毒，無(wú)菌條件下逐層切開(kāi)大鼠陰囊皮膚、包膜組織、提睪肌，暴露睪丸后摘除雙睪丸，結(jié)扎殘端，徹底止血，然后全層縫合。對(duì)皮后，生理鹽水棉球擦凈陰囊外血跡，術(shù)后觀察切口愈合情況，注意保持鼠籠清潔，防止切口感染。假手術(shù)組:手術(shù)方法同造模組，但僅暴露睪丸不予摘除，然后全層縫合。所有進(jìn)行手術(shù)操作后的大鼠均肌肉注射青霉素注射液80IU/d，連續(xù)注射6d，預(yù)防傷口感染。

1.2.2 注射激素 將丙酸睪丸酮注射液與橄欖油按4∶1的比例兌勻，制成濃度為5mg/m1的油性液，對(duì)行去勢(shì)手術(shù)的大鼠在術(shù)后第7天開(kāi)始頸背部皮下注射，每只大鼠按5mg/kg的量注射，連續(xù)注射給藥21d，制成BPH大鼠模型。

1.2.3 腎虛血瘀證BPH模型復(fù)制模型的復(fù)制行去勢(shì)手術(shù)的大鼠在術(shù)后1周，觀察傷口已愈合，未見(jiàn)感染現(xiàn)象。將大鼠下半身置于冰水中，每日不少于30 min，連續(xù)21d。然后從模型組隨機(jī)抽取2只大鼠，取血檢測(cè)血流變，處死后取前列腺組織，看是否有出血或瘀血塊以確定血瘀證造模成功。

1.2.4 動(dòng)物分組 各組大鼠按下述方法給藥(1)空白組:普通飼養(yǎng)，自29d起給予0.1ml/kg/d生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)4周;(2)假手術(shù)組:普通飼養(yǎng)，自29d起給予0.1ml/kg/d生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)4周;(3)模型組:造模成功后第2天，給予0.1ml/kg/d生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)4周;(4)前列癃閉通片干預(yù)組(前癃組)，造模成功后第2天，按照0.625g/kg/d配備前列癃閉通片溶液灌胃，每日1次，連續(xù)4周。

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.3.1 血流變學(xué)檢測(cè) 用吸管吸取1mL全血，于自清洗旋轉(zhuǎn)式黏度儀測(cè)定全血黏度各切變率和血漿黏度。

1.3.2 前列腺濕重檢測(cè)及指數(shù)的計(jì)算 取出前列腺仔細(xì)分離各葉前列腺，用電子天平稱大鼠前列腺濕重，并根據(jù)電子分析天平測(cè)量的大鼠體質(zhì)量計(jì)算前列腺指數(shù)。前列腺指數(shù)=前列腺濕重(mg)/體質(zhì)量(g)×100%。

1.3.3 前列腺組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 (1)脫水及包埋:將固定好的前列腺組織經(jīng)常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋;(2)切片:連續(xù)切片，片厚5μm，每隔20張取蠟帶貼于涂有蛋白甘油的載玻片上;(3)HE染色:常規(guī)蘇木精—伊紅染色、脫水、透明、封片;(4)觀察:光學(xué)顯微鏡下觀察前列腺的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。

1.3.4 血清前列腺特異性酸性磷酸酶(PAP)含量的檢測(cè) 腹主動(dòng)脈取血加入肝素鈉抗凝，15min后用低溫離心機(jī)離心10min(3000r/min)，分離血清置于 －20℃冰箱內(nèi)保存，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定總酸性磷酸酶(ACP)和非前列腺特異性酸性磷酸酶(NPAP)。PAP=ACP-NPAP。按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程操作，并計(jì)算各樣品中PAP的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，多組間比較采用單因素方差分析，2組間比較采用SNK-q法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物基線情況

表1顯示，各組大鼠實(shí)驗(yàn)前體重經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＞0.05為差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

表1 各組大鼠體質(zhì)量(珋x±s)

2.2 模型大鼠血流變學(xué)指標(biāo)變化

29d后模型組、空白組、假手術(shù)組隨機(jī)抽取2只大鼠，眼底靜脈取血2ml，肝素抗凝后檢測(cè)血液流變學(xué)指標(biāo)。結(jié)果顯示，模型組大鼠全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和卡松黏度均明顯高于空白組、假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，由此可提示大鼠血瘀證模型制造成功(見(jiàn)圖1)。

2.3 各組大鼠體質(zhì)量、前列腺濕重和前列腺指數(shù)比較

各組大鼠治療后體質(zhì)量比較顯示，空白組、假手術(shù)組和模型組3組大鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);前癃通組大鼠體質(zhì)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和卡松黏度柱狀圖注:與空白組比較:#P＜0.05，與假手術(shù)組比較:※P＜0.05

各組大鼠治療后前列腺濕重比較顯示，與空白組、假手術(shù)組比較，模型組前列腺濕重增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與模型組比較，前癃通組的前列腺濕重減小(P＜0.05)。

表2顯示，各組大鼠治療后前列腺指數(shù)比較顯示，與空白組、假手術(shù)組比較，模型組前列腺指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與模型組比較，前癃通組前列腺指數(shù)均減小 (P＜0.05)。

表2 各組大鼠體重、前列腺濕重和前列腺指數(shù)比較(珋x±s)

2.4 各組大鼠前列腺組織病理學(xué)變化的比較

圖2顯示，空白組前列腺上皮細(xì)胞排列清楚，腺上皮單層柱狀，可見(jiàn)少許扁平狀基底細(xì)胞及明顯基底膜，腔大，腔內(nèi)充滿分泌物，間質(zhì)、纖維組織含量無(wú)增加。假手術(shù)組與空白組形態(tài)學(xué)表現(xiàn)相似，間質(zhì)較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組可見(jiàn)腺上皮皺縮，部分區(qū)域?qū)哟卧黾?、排列紊亂，多數(shù)腺上皮呈乳頭狀突向腔內(nèi)成鋸齒狀，腺體僵硬感，腔內(nèi)分泌物少，間質(zhì)增寬，結(jié)締組織增生，間質(zhì)纖維組織及平滑肌組織增多。前癃通組可見(jiàn)腺上皮增生不明顯，腺腔分泌物少，間質(zhì)細(xì)胞增生，但結(jié)締組織增生不明顯。

2.5 各組大鼠血清PAP含量的比較

表3顯示，與空白組、假手術(shù)組比較，模型組血清PAP的含量升高(P＜0.05);與模型組比較，前癃通組血清PAP的含量降低(P＜0.05)。

3 討論

圖2 大鼠前列腺組織HE染色(×250)注:A.空白組，B.假手術(shù)組，C.模型組，D.前癃通組

國(guó)內(nèi)外目前BPH模型成功報(bào)道很多，動(dòng)物涉及小鼠、大鼠、兔、貓、豬、犬等，但建模方法各式各樣，尚未完全統(tǒng)一。目前用于研究前列腺增生的動(dòng)物模型有以下幾種:(1)異體移植:將BPH患者病變組織異體移植到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物前列腺內(nèi)，可形成典型的前列腺上皮和間質(zhì)增生［3］;(2)轉(zhuǎn)基因:將 Int-2(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族成員之一)導(dǎo)入小鼠受精卵中可以引起前列腺腺體及膀胱增生，但未觀察到前列腺間質(zhì)增生［4］;(3)注射丙酸睪酮:以大鼠和犬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，肌肉注射丙酸睪酮，組織學(xué)觀察大鼠前列腺上皮增生明顯，而間質(zhì)增生并不明顯［5］;而成年犬前列腺間質(zhì)增生較為明顯［6］。由于肌肉注射丙酸睪酮建立大鼠模型的方法操作簡(jiǎn)單且成功率高，已成為目前最常用BPH動(dòng)物模型;(4)尿生殖竇植入法:將同系胎鼠尿生殖竇植入成年雄性小鼠的前列腺，可誘導(dǎo)上皮和間質(zhì)明顯增生［7］;(5)自然增生動(dòng)物模型:在哺乳動(dòng)物中，只有人類和犬類才可能發(fā)生前列腺的自然增生［8］。老年犬可用作研究前列腺自然增生的動(dòng)物模型［9］。迄今犬被公認(rèn)為是研究前列腺增生的一種合適的動(dòng)物模型［10］。但要選用前列腺增生的老年犬做實(shí)驗(yàn)，不僅價(jià)格昂貴且數(shù)量有限，因此用犬來(lái)做實(shí)驗(yàn)研究受到一定程度的限制。王毅等［11］給予去勢(shì)大鼠雄激素(TP)也可建立前列腺增生癥模型。用小鼠復(fù)制前列腺增生模型，具有價(jià)廉易得、方法簡(jiǎn)單可行的優(yōu)點(diǎn)，所以也常被采用。但目前尚缺少病證結(jié)合模型，影響中藥療效及藥物機(jī)理的研究，病證結(jié)合模型也是研究者們研究的熱點(diǎn)課題之一。

表3 各組大鼠血清前列腺PAP含量的比較(珋x±s)

通過(guò)對(duì)中醫(yī)文獻(xiàn)的研究和多年從事中醫(yī)男性病診治的臨床體會(huì)，何清湖教授［2］認(rèn)為腎虛是 BPH發(fā)生的基本條件，血瘀是BPH改變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，腎虛和血瘀相互影響構(gòu)成BPH的關(guān)鍵病機(jī)。進(jìn)而在該認(rèn)識(shí)基礎(chǔ)上立法處方用藥，獲得了克癃膠囊這一治療BPH的有效藥物。本研究探討克隆膠囊治療BPH的作用機(jī)制，根據(jù)中醫(yī)證法方藥相對(duì)應(yīng)的原則，首先采用去勢(shì)手術(shù)復(fù)制大鼠中醫(yī)腎虛證型，又據(jù)“寒則凝滯”這一理論采用冰浴方法促進(jìn)瘀血形成，獲得BPH腎虛血瘀證動(dòng)物模型。

對(duì)模型組、空白組和假手術(shù)組的研究發(fā)現(xiàn)，模型組前列腺濕重、指數(shù)明顯高于空白組和假手術(shù)組(P＜0.01)，模型組前列腺組織較空白組有明顯增生，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)制作的大鼠BPH模型是成功的。同時(shí)，模型組大鼠全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和卡松黏度均明顯高于空白組和假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。且模型組大鼠前列腺組織病理組織學(xué)觀察可見(jiàn)，小血管擴(kuò)張、充血，符合瘀血的病理表現(xiàn)，由此可以認(rèn)為大鼠血瘀證模型制造成功。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，課題組采用去勢(shì)手術(shù)、激素注射+冰浴方法，成功復(fù)制了 BPH腎虛血瘀證大鼠模型，為中醫(yī)藥研究防治BPH提供了可靠、科學(xué)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

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