HPLC 法測(cè)定馬錢(qián)子緩釋片中士的寧與馬錢(qián)子堿

陳曉莉，李永吉，王錄娜，孫佳琳，劉 婷，管慶霞

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

馬錢(qián)子為馬錢(qián)科植物馬錢(qián)(Strychnos nux－vomica L.)的干燥成熟種子，收載于中國(guó)藥典2010年版一部［1］，具有通絡(luò)止痛、散結(jié)消腫［2－5］的功效.近年研究表明［6－10］馬錢(qián)子總生物堿有抗炎、抗心律失常、抗血小板聚集、免疫調(diào)節(jié)以及抗菌、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等作用.馬錢(qián)子總生物堿中的士的寧和馬錢(qián)子堿既是活性成分又是毒性成分，故要保證馬錢(qián)子的臨床療效，必須確保士的寧、馬錢(qián)子堿的質(zhì)量濃度以達(dá)到既能降低毒性又最大限度保留有效成分［11］.所以本文著重研究了HPLC 法測(cè)定馬錢(qián)子總生物堿的有效成分士的寧和馬錢(qián)子堿的質(zhì)量濃度，結(jié)果顯示該方法簡(jiǎn)便、靈敏、專(zhuān)屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確可靠，可為考察本品的質(zhì)量與穩(wěn)定性提供參考，同時(shí)為研制中藥緩釋制劑奠定了科學(xué)基礎(chǔ).

1 儀器與試藥

美國(guó) Waters 公司高效液相色譜儀(2996Photodiode Array Detector、2695 Separation Module、Empower 色譜工作站);AB265－S 電子分析天平(德國(guó)梅特勒公司);超聲波發(fā)生器(浙江象山石浦海天電子儀器廠).

士的寧、馬錢(qián)子堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所);甲醇(美國(guó)Dikma 公司)為色譜純;重蒸餾水(自制);其他試劑均為分析純.

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性考察

2.1.1 色譜條件

譜柱:Diamonsil C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇－水－乙酸－三乙胺(76∶230∶2.4∶0.3);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;柱溫:30 ℃.色譜圖見(jiàn)圖1.

圖1 馬錢(qián)子總生物堿高效液相色譜圖

2.1.2 系統(tǒng)適應(yīng)性考察

以士的寧的色譜峰計(jì)算，理論塔板數(shù)不少于3 000，對(duì)稱(chēng)因子為0.95～1.05，士的寧相臨組分的分離度R≥1.5，滿(mǎn)足樣品分析檢測(cè)要求.

2.2 專(zhuān)屬性考察

按馬錢(qián)子總生物堿緩釋片處方中輔料的配比稱(chēng)取各輔料，充分混合后得不含馬錢(qián)子總生物堿的空白輔料，稱(chēng)取相當(dāng)于處方中一片劑量的空白輔料，用900 mL 釋放介質(zhì)溶解，超聲混勻，得到空白輔料溶液.取馬錢(qián)子總生物堿緩釋片3 片，用研缽研成細(xì)粉，充分混合后稱(chēng)取相當(dāng)于處方中一片劑量的粉末，用900 mL 釋放介質(zhì)溶解，超聲混勻，得到緩釋片溶液.分別取兩種溶液適量，用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，注入液相色譜儀.由圖可見(jiàn)，馬錢(qián)子總生物堿主要成分分離良好，空白釋放介質(zhì)不干擾測(cè)定.

2.3 供試品溶液的制備

取馬錢(qián)子生物堿緩釋片10 片，研成細(xì)粉末，稱(chēng)取適量粉末加蒸餾水100 mL，超聲5 min 溶解，過(guò)濾，續(xù)濾液備用.

2.4 對(duì)照品溶液的制備

稱(chēng)取士的寧、馬錢(qián)子堿對(duì)照品約2.4、2 mg，精密稱(chēng)定，置同一50 mL 量瓶中，蒸餾水至刻度，超聲5 min 溶解，作為對(duì)照品貯備液備用.

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

分別將2.1 項(xiàng)下的對(duì)照品貯備液用蒸餾水稀釋成質(zhì)量濃度不同的系列混合對(duì)照品溶液，超聲充分溶解，其中士的寧的質(zhì)量濃度分別為1.2、2.4、4.8、9.6、14.4 μg/mL;馬錢(qián)子堿的質(zhì)量濃度為1.0、2.0、4.0、8.0、12.0 μg/mL，進(jìn)樣40 μL，在上述色譜條件下分離測(cè)定，記錄色譜圖與峰面積.以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn).士的寧:A=68 806C－32 976，r=0.9999;馬錢(qián)子堿:A=35 889C－14 337，r=0.9998 結(jié)果表明，士的寧在1.2～14.4 μg/mL，馬錢(qián)子堿在1.0～12.0 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好線(xiàn)性關(guān)系，見(jiàn)圖2.

圖2 高效液相色譜圖

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液40 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積并計(jì)算質(zhì)量濃度.結(jié)果士的寧的RSD為0.57%(n=6)，馬錢(qián)子堿RSD為1.15%(n=6)，表明精密度良好.

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取馬錢(qián)子生物堿緩釋片供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果士的寧的RSD為1.12%，馬錢(qián)子堿RSD為1.02%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定.

2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液適量置10 mL 量瓶中，加入對(duì)照品溶液貯備液0.5、0.8、1.0 mL，蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1、2.

表1 士的寧的準(zhǔn)確度試驗(yàn)數(shù)據(jù)

表2 馬錢(qián)子堿準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.9 樣品處理方法的考察

考察了蒸餾水為溶劑，超聲時(shí)間對(duì)馬錢(qián)子生物堿緩釋片中士的寧、馬錢(qián)子堿提取的影響，通過(guò)測(cè)定不同時(shí)間超聲時(shí)間所得制劑中有效成分的質(zhì)量濃度變化，確定將制劑中有效成分提取完全的條件.

取馬錢(qián)子生物堿緩釋片10 片，用研缽研細(xì)，精密稱(chēng)取一定量的粉末(含主藥5 mg)3 份，置100 mL 量瓶中，加入蒸餾水至刻度，分別超聲5.0、10.0、15.0 min 使待測(cè)組分充分溶解.用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液40 μL 注入液相色譜儀，計(jì)算質(zhì)量濃度，考察不同超聲時(shí)間對(duì)待測(cè)組分溶解的影響.結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 樣品處理方法影響結(jié)果

由表3 可知，超聲5 min 即能使待測(cè)成分完全溶解，可擬定超聲時(shí)間為5 min.

2.10 樣品中士的寧、馬錢(qián)子堿質(zhì)量濃度測(cè)定方法及結(jié)果

分別取三批緩釋片20 片，用研缽研細(xì)，精密稱(chēng)取一片緩釋片重量的粉末，加蒸餾水900 mL，超聲5 min 使主藥充分溶解后加蒸餾水至刻度，搖勻，以0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，續(xù)濾液作為供試液.取供試液40 μL 于進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算3 批樣品質(zhì)量濃度，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4.

表4 馬錢(qián)子緩釋片中士的寧和馬錢(qián)子堿的質(zhì)量濃度

三批緩釋片中士的寧、馬錢(qián)子堿平均每片質(zhì)量濃度分別為8.10、6.78 mg.

3 討論

實(shí)驗(yàn)曾以乙腈－0.01 mol/L 庚烷磺酸鈉與0.02 mol/L 磷酸二氫鉀等量混合溶液(10%H3PO4調(diào)pH值為2.8)為流動(dòng)相，雖然也能使士的寧、馬錢(qián)子堿與其他組份完全分離，但色譜柱柱效降低.最終選擇的流動(dòng)相未使用磷酸鹽和價(jià)格較高的乙腈，有利于延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命.流動(dòng)相選擇甲醇－水－乙酸－三乙胺(76∶230∶2.4∶0.3)，基線(xiàn)穩(wěn)定，峰形良好，可獲得較好的分離效果，保留時(shí)間較適宜.流動(dòng)相中加入了有機(jī)堿三乙胺，不但可以調(diào)節(jié)生物堿的保留時(shí)間以期與其他組分分離，亦是硅基固定相的掃尾劑，它的加入對(duì)士的寧與馬錢(qián)子堿的分離狀況尤為重要.

馬錢(qián)子中的主要成分為生物堿類(lèi)化合物，其質(zhì)量濃度為質(zhì)量控制的主要內(nèi)容.鑒于中藥的廣泛性和成分復(fù)雜性，必須從原料購(gòu)得開(kāi)始到制成成品的過(guò)程中進(jìn)行全面的質(zhì)量濃度質(zhì)量控制.為此，特建立了馬錢(qián)子總生物堿原料藥主要成分質(zhì)量濃度測(cè)定方法HPLC 方法，馬錢(qián)子生物堿緩釋片中主要成分的HPLC 方法，這種原料―成品的質(zhì)量控制方式可較全面的控制馬錢(qián)子生物堿緩釋片的質(zhì)量，方法穩(wěn)定，結(jié)果準(zhǔn)確.馬錢(qián)子總生物堿以士的寧、馬錢(qián)子堿為指標(biāo)成分進(jìn)行質(zhì)量濃度測(cè)定的，主要原因是二者為馬錢(qián)子的主要有效成分亦即主要毒性成分.《中國(guó)藥典》及文獻(xiàn)記載以通過(guò)測(cè)定士的寧、馬錢(qián)子堿的質(zhì)量濃度來(lái)評(píng)價(jià)馬錢(qián)子及其各類(lèi)炮制品、制劑質(zhì)量.故要保證馬錢(qián)子的臨床療效，必須確保士的寧、馬錢(qián)子堿的質(zhì)量濃度以達(dá)到既能降低毒性又最大限度保留有效成分.所以士的寧和馬錢(qián)子堿質(zhì)量濃度如何，直接關(guān)系到患者的用藥安全，可作為藥材質(zhì)量首先考查的指標(biāo).利用這種檢測(cè)主要成分質(zhì)量濃度的質(zhì)控達(dá)到全面控制馬錢(qián)子生物堿緩釋片質(zhì)量的目的.

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