標(biāo)準(zhǔn)化臨床樣本庫的創(chuàng)建與管理

楊靜芳， 陳 凌， 張新勝， 卞琳琳， 吉訓(xùn)明

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，北京市老年病醫(yī)療研究中心科研處，北京 100053)

0 引言

標(biāo)準(zhǔn)化、高質(zhì)量的樣本庫是重大疾病基礎(chǔ)與臨床研究、臨床診治技術(shù)研發(fā)、藥物研發(fā)、健康研究與產(chǎn)業(yè)化，即實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的最寶貴資源。隨著生物醫(yī)藥研究的飛速發(fā)展，臨床樣本資源的重要性已經(jīng)得到廣泛的重視和充分的認(rèn)識。臨床樣本是不可再生的寶貴資源，高質(zhì)量的臨床研究樣本對探索新的治療方法、發(fā)現(xiàn)新的診斷工具、制定新的診斷指標(biāo)以及新藥的研發(fā)都凸顯出極其重要的意義。醫(yī)學(xué)臨床樣本的收集管理和利用日益引起發(fā)達(dá)國家醫(yī)學(xué)研究工作者的重視，國外早已建立了標(biāo)準(zhǔn)化的樣本庫且信息化管理機(jī)制不斷完善。目前，國際知名的樣本庫有聯(lián)合了幾大歐洲重點(diǎn)生物庫的泛歐洲生物樣本庫與分子生物資源研究中心(BBMRIhttp://www.bbmri.eu)，英國生物樣本庫(UK Biobank，http://www.ukbiobank.ac.uk)及法國國家健康與醫(yī)學(xué)研究院 (INSERM，http://www.english.inserm.fr)等。

中國有龐大的臨床樣本資源，且有能力將其妥善處理并加以保存。建設(shè)高質(zhì)量、高標(biāo)準(zhǔn)的樣本庫將給我國的生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)、生命科學(xué)的基礎(chǔ)研究和臨床研究提供強(qiáng)有力的支撐[1]。然而，目前我國綜合醫(yī)院臨床樣本庫建設(shè)尚處于初創(chuàng)階段，由于缺乏足夠的交流與溝通，不同的樣本庫在建設(shè)過程中沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，在管理和質(zhì)量水平上存在角度的差別，同國外的樣本庫也存在著一定的差距[2]。近期，通過實(shí)地調(diào)研及國際交流等方式，就綜合醫(yī)院臨床樣本庫的建立與管理做了一些相應(yīng)的考察、研究和分析。

1 資料與方法

(1)文獻(xiàn)復(fù)習(xí)。通過清華同方中國期刊全文數(shù)據(jù)庫(CNKI)、中國科技論文統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)庫(CSTP)及萬方數(shù)據(jù)庫，以“樣本庫”為關(guān)鍵詞，檢索2006～2011年相關(guān)中文文獻(xiàn)。共獲得文獻(xiàn)81篇，選取其中與醫(yī)學(xué)衛(wèi)生或生物科學(xué)相關(guān)且有代表性的22篇文獻(xiàn)進(jìn)行學(xué)習(xí)，對樣本庫的建設(shè)和管理有了理論認(rèn)識。

(2)實(shí)地調(diào)研。2011年6月赴上海對第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院國家肝癌樣本庫[3-4]進(jìn)行實(shí)地調(diào)研，并與樣本庫管理人員、工作人員及樣本管理系統(tǒng)的軟件開發(fā)人員(上海生物信息技術(shù)研究中心)進(jìn)行面對面交流，學(xué)習(xí)建庫的成功經(jīng)驗(yàn)。該樣本庫啟動于2008年，依托于國家科技重大專項(xiàng)課題建立了專業(yè)性的肝癌樣本庫，利用雙重條形碼技術(shù)結(jié)合樣本信息化管理系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了臨床組織樣本庫的標(biāo)準(zhǔn)化管理[5-7]，是臨床組織樣本庫標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)試點(diǎn)單位之一。

(3)國際交流。2010年10月參加2010第二屆中國組織生物樣本庫的標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)與應(yīng)用研討會，于2011年7月參加國際標(biāo)準(zhǔn)化生物樣本庫的管理與質(zhì)控會議暨2011年上海生物樣本庫建設(shè)研討會，于2012年6月參加第四屆中國生物樣本庫標(biāo)準(zhǔn)化建立與應(yīng)用研討會，于2013年3月參加《ISBER最佳實(shí)踐2012》培訓(xùn)，于2013年4月參加《生物樣本庫質(zhì)量管理實(shí)戰(zhàn)培訓(xùn)》[8-11]。目前，有關(guān)生物樣本庫的國際交流平臺主要集中在上海，歷次會議匯集了泛歐洲生物樣本庫與分子生物資源研究中心(BBMRI)、英國生物樣本庫(UK Biobank)、法國國家健康與醫(yī)學(xué)研究院(INSERM)等國際著名的生物樣本庫建設(shè)主體單位負(fù)責(zé)人及國內(nèi)知名樣本庫的負(fù)責(zé)人。會議期間，通過與國內(nèi)外專家學(xué)者進(jìn)行面對面的交流討論，深刻領(lǐng)悟了樣本庫建設(shè)的重大意義及標(biāo)準(zhǔn)化管理的迫切性。

(4)政策法規(guī)及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)學(xué)習(xí)。通過互聯(lián)網(wǎng)檢索國際及國內(nèi)有關(guān)遺傳資源及樣本庫建設(shè)方面的政策法規(guī)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、技術(shù)規(guī)范、標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)等文件。學(xué)習(xí)并了解了國際上的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)一般遵循ISO 9001認(rèn)證或OECD(Organization for Economic Co-operation and Development)指南。而我國目前沒有統(tǒng)一的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，對樣本庫的資質(zhì)也沒有統(tǒng)一的國家認(rèn)證。我國臨床樣本庫的現(xiàn)狀是，依托于研究項(xiàng)目或課題的資金資助，建立適用于各自項(xiàng)目的技術(shù)規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)體系。所謂“標(biāo)準(zhǔn)化”實(shí)際上很難統(tǒng)一，短時(shí)間內(nèi)很難建立國家的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。由于人類遺傳資源的特殊性質(zhì)，涉及倫理學(xué)問題，因此，國際上遵循HUGO倫理委員會章程，而我國于1998年出臺的《人類遺傳資源管理暫行辦法》(國辦發(fā)[1998]36號)則為遺傳資源的保護(hù)、開發(fā)利用及倫理學(xué)方面提供了法律依據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 臨床樣本庫的建立

(1)基礎(chǔ)設(shè)施與儀器設(shè)備。要求具有獨(dú)立空間，設(shè)置專門的庫房，面積根據(jù)樣本庫庫存量而定，但基本的區(qū)域應(yīng)該具備:標(biāo)本出入庫登記區(qū)、標(biāo)本處理區(qū)、臨床資源數(shù)據(jù)庫區(qū)、冷凍區(qū)(劃分－80℃超低溫冰箱、－150℃液氮罐兩個(gè)溫度冷凍區(qū))、標(biāo)本分析區(qū)等(見圖1)。另外，樣本庫必須具備專用電源及備用電源、空調(diào)及實(shí)時(shí)監(jiān)控設(shè)施。

圖1 樣本庫架構(gòu)

(2)實(shí)施方案與技術(shù)路線。臨床樣本庫建立的基本路線是收集、保存、利用，其基本原則是臨床醫(yī)生提出需求，針對某種疾病的樣本進(jìn)行有目的收集，而不是任何臨床樣本都要收集。① 臨床醫(yī)生一定要參與樣本收集，與患者或家屬簽署知情同意書，并對臨床信息進(jìn)行采集，以保證標(biāo)本的相關(guān)資料收集保存完整。②樣本庫的工作人員需具有責(zé)任心及相應(yīng)的專業(yè)技術(shù)知識，樣本收集的關(guān)鍵在于樣本的質(zhì)量，操作過程應(yīng)避免外界污染以及標(biāo)本之間的交叉污染，嚴(yán)格控制標(biāo)本離體時(shí)間，從而確保標(biāo)本的質(zhì)量，樣本的收集一定按照嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP，見圖2)，每個(gè)崗位由專人負(fù)責(zé)，并進(jìn)行崗前培訓(xùn)。③樣本庫建立目的是為了利用，只有充分利用樣本庫的資源達(dá)到物盡其用，才能避免“垃圾進(jìn)，垃圾出”的后果。最后，樣本庫的成敗在于規(guī)范化管理，只有按照一定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行收集、保存及利用，才能真正發(fā)揮樣本庫的作用，為臨床研究服務(wù)。總之，臨床樣本庫的建立和正常運(yùn)行需要醫(yī)院各部門(臨床科室、手術(shù)室、病理科、設(shè)備科)協(xié)調(diào)配合，尤其需要醫(yī)院領(lǐng)導(dǎo)的大力支持，并得到本單位倫理委員會的批準(zhǔn)。

圖2 樣本采集標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

2.2 標(biāo)本的質(zhì)量控制

(1)組織標(biāo)本的收集、處理及保存。取材部位必須準(zhǔn)確，一定要由病理科醫(yī)生進(jìn)行取材，在腫瘤組織離體30 min內(nèi)，在保證醫(yī)院病理科留取足夠用于診斷的組織標(biāo)本后，按癌、癌旁(距離腫瘤組織2 cm的組織)和切緣遠(yuǎn)端非癌組織(正常組織)，分別切成數(shù)小塊，根據(jù)應(yīng)用范圍做下述3種處理:①用于RNA提取的組織:將組織標(biāo)本切成厚度小于0.5 cm的小塊，投入到5倍體積的RNAlater試劑中，4℃浸泡過夜，第2 d從RNAlater中取出標(biāo)本，放于凍存管中，－80℃保存。②用于DNA及蛋白提取的組織:切取小塊標(biāo)本不經(jīng)處理，直接放入凍存管中，置于液氮處理30 min，再轉(zhuǎn)入－80℃超低溫冰箱保存。③用于石蠟包埋的組織:標(biāo)本取材后立即置10%中性甲醛水溶液固定過夜，流水沖洗約3 h，然后放入自動脫水機(jī)脫水、透明、浸蠟，再用石蠟包埋，制成蠟塊。所有的石蠟包埋組織均進(jìn)一步切片，HE染色，鑒定組織形態(tài)。蠟塊和切片分別歸檔保存，HE染色切片在顯微鏡下照相存于電腦數(shù)據(jù)庫中。

(2)血液標(biāo)本的收集、處理及保存。采集患者血液標(biāo)本10 mL，抗凝血和非抗凝血各5 mL，做如下處理:①非抗凝血采集后室溫靜置2～3 h，以3 000 rpm離心5 min，吸出上層血清，分裝到10支凍存管內(nèi)，每管約200 μL，凍存于－80℃超低溫冰箱。②抗凝血以3 000 r/min離心5 min，吸出上層血漿，分裝到凍存管中，凍存于－80℃保存。③分離血漿后的下層血液，用生理鹽水反復(fù)洗滌并離心分離白細(xì)胞后，用鹽析法提取基因組DNA，分裝凍存管中，－80℃保存。

(3)標(biāo)本信息資料的記錄。主要包括以下內(nèi)容:病人的一般資料(姓名、性別、年齡、民族、職業(yè)、聯(lián)系方式、住院號、病例摘要、臨床診斷、病理診斷、實(shí)驗(yàn)室檢查、其他檢查等);標(biāo)本資料(入庫編號、入庫時(shí)間、病變部位、標(biāo)本描述、標(biāo)本類型、標(biāo)本數(shù)量、庫存位置等);標(biāo)本使用資料(出庫編號、出庫時(shí)間、出庫數(shù)量、標(biāo)本類型、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容、實(shí)驗(yàn)結(jié)果、使用人、使用日期、審批人等);標(biāo)本廢除資料(廢除序號、廢除原因、入庫編號、標(biāo)本原庫存位置、廢除日期、經(jīng)手人等)。

(4)標(biāo)本的定期隨機(jī)抽樣質(zhì)控。對庫存標(biāo)本定期隨機(jī)抽樣進(jìn)行總RNA提取鑒定，對RNA樣品經(jīng)紫外分光光度計(jì)分析，若得出A260/A280﹥1.6，1%瓊脂糖凝膠電泳后，可見明顯的28 s和18 s條帶，而且28 s的亮度大約是18 s的1～2倍，表明RNA保存比較完整。

2.3 標(biāo)本庫的規(guī)范化管理

(1)數(shù)據(jù)庫管理。在臨床樣本庫中，有大量資料需要記錄，包括患者信息、臨床資料、病理資料、標(biāo)本信息和隨訪信息等。建立一套組織科學(xué)合理、信息全面而專業(yè)化的標(biāo)本庫管理系統(tǒng)，對各類標(biāo)本信息進(jìn)行完善的組織和管理，是創(chuàng)建標(biāo)本庫的前提條件[12]。標(biāo)本管理系統(tǒng)可以根據(jù)本單位情況自行開發(fā)設(shè)計(jì)，也可以請專業(yè)的軟件開發(fā)公司個(gè)性化定制。目前，很多公司開發(fā)了針對大型臨床樣本庫而設(shè)計(jì)的標(biāo)本管理軟件系統(tǒng)，系統(tǒng)運(yùn)行平臺一般基于Windows XP操作系統(tǒng)?？紤]到數(shù)據(jù)庫的安全及運(yùn)行速度，最好配有獨(dú)立的服務(wù)器，以保證數(shù)據(jù)庫的高安全性和高容量。隨著醫(yī)學(xué)信息系統(tǒng)的日益普及和完善，作為物流跟蹤過程中的關(guān)鍵技術(shù)“條形碼技術(shù)”已在臨床醫(yī)學(xué)中得到應(yīng)用。第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院建立的國家肝癌樣本庫采用雙重條形碼定位技術(shù)，同一個(gè)樣本具有兩個(gè)條形碼標(biāo)簽，一個(gè)是樣本編碼，另一個(gè)是定位編碼，其編碼規(guī)則一目了然，即使由于疏忽導(dǎo)致樣本放錯(cuò)位置，也可以根據(jù)定位編碼很容易找到其相應(yīng)位置。目前，最新出現(xiàn)的二維碼技術(shù)[13]解決了樣本信息容量的問題，但是編碼不直觀，只能通過計(jì)算機(jī)掃描識別。另外，樣本庫信息管理系統(tǒng)需具備與醫(yī)院HIS系統(tǒng)接口，以便提取患者的基本信息和檢驗(yàn)、治療、病理及隨訪等信息。

(2)標(biāo)本庫管理。建立統(tǒng)一的管理規(guī)范，明確工作環(huán)節(jié)中的規(guī)章制度，從入庫到出庫都必須有章可循。標(biāo)本庫的工作人員編制相對固定，需具備一定的技術(shù)水平和實(shí)驗(yàn)室管理能力，明確標(biāo)本庫工作人員職責(zé)，實(shí)現(xiàn)專人負(fù)責(zé)，加強(qiáng)對各崗位工作人員專業(yè)知識培訓(xùn)，并增強(qiáng)對標(biāo)本庫維護(hù)的責(zé)任感，保證標(biāo)本從收集、保存到利用整個(gè)過程有條不紊進(jìn)行。目前，中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會組織生物樣本庫分會頒布了生物樣本庫標(biāo)準(zhǔn)[14]，規(guī)范了我國生物樣本庫的管理。

3 討論

隨著人類基因組計(jì)劃的完成，為重大疾病諸如腫瘤、心血管疾病、代謝性疾病、老年病、精神疾病及遺傳病等相關(guān)基因的功能研究提供了基本藍(lán)圖。利用人類基因組工作所取得的成果，研究和了解與生理和疾病相關(guān)的基因或遺傳因素的前提就是要有疾病相關(guān)的遺傳資源，包括遺傳物質(zhì)如DNA、病變組織及臨床流行病學(xué)資料等。因此，遺傳資源已成為21世紀(jì)重大疾病研究中最具有依賴性的因素。

目前，生命科學(xué)界清楚地認(rèn)識到，世界范圍內(nèi)的遺傳資源(生物樣本庫)網(wǎng)絡(luò)的創(chuàng)立和協(xié)作將成為重建現(xiàn)代生物基因組和后基因組至關(guān)重要的一步。我國也將重大疾病遺傳資源收集和保存、利用列入“十五”重大科技專項(xiàng)“人類重大疾病相關(guān)基因的研究”項(xiàng)目的子課題[15]。但是目前，這些重大疾病遺傳資源的收集、保存和利用工作還存在許多問題:① 樣本收集隨機(jī)性且無代表性;②缺乏多學(xué)科研究人員的協(xié)作;③缺乏嚴(yán)格的程序規(guī)范及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn);④遺傳資源的利用率低下;⑤倫理學(xué)立法有待完善。

4 結(jié)語

生物樣本庫已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)研究和藥品研發(fā)領(lǐng)域新的必備基礎(chǔ)和來源，它所承載的歷史使命極具挑戰(zhàn)性。①建立和維護(hù)一個(gè)大型的生物樣本庫，不僅僅是一項(xiàng)簡單的收集工作，而是要通過樣本庫將現(xiàn)有的寶貴的遺傳資源轉(zhuǎn)化成基因?qū)W研究的新工具，從而賦予其特定的知識價(jià)值，促進(jìn)醫(yī)學(xué)科學(xué)發(fā)展。②樣本庫既不可能快速建立，也不容易維護(hù)，更是難以在短時(shí)間內(nèi)成為現(xiàn)代生物醫(yī)藥研發(fā)中的一個(gè)完整有效的組成部分。樣本庫涉及各種復(fù)雜和交叉的知識體系網(wǎng)絡(luò)，其發(fā)展取決于眾多因素。最后，樣本庫創(chuàng)造價(jià)值的能力，取決于管理體系的建立和有序模式的建立。為了是一個(gè)樣本庫能夠正常運(yùn)轉(zhuǎn)，必須要建立一系列樣本研究的科學(xué)有效性的質(zhì)量管理機(jī)制。

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