RP-HPLC法測(cè)定甲硝唑氯化鈉注射液中乙二胺四乙酸二鈉的含量

江蘇省鹽城市藥品檢驗(yàn)所（224002）周會(huì)芹 王梅娟

甲硝唑氯化鈉注射液中的甲硝唑是硝基咪唑衍生物，對(duì)大多數(shù)厭氧菌具有強(qiáng)大的抗菌作用，但對(duì)需氧菌和兼性厭氧菌無(wú)作用。在臨床使用時(shí)，甲硝唑氯化鈉注射液有時(shí)出現(xiàn)混濁現(xiàn)象。有研究表明，甲硝唑氯化鈉注射液處方中添加乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）后可顯著提高其穩(wěn)定性，其原理為EDTA與輸液中微量的金屬離子形成螯合物后，阻止了金屬離子對(duì)藥物自身氧化的催化作用。因此在甲硝唑氯化鈉注射液處方中添加一定量的EDTA作為螯合劑，顯著改善了輸液的配伍穩(wěn)定性。但如人體大量攝入EDTA時(shí)，則會(huì)與血液及骨骼中經(jīng)過(guò)的鈣形成水溶性螯合物，被排出體外，引起低血鈣癥或骨鈣流失，因此有必要對(duì)EDTA的含量進(jìn)行控制，雖然已有EDTA的檢查報(bào)道，但方法不能定量檢測(cè)，為確保用藥安全，筆者參照相關(guān)文獻(xiàn)，建立了甲硝唑氯化鈉注射液中EDTA的含量測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

Agilent高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）Agilent-1200色譜工作站（美國(guó)Agilent公司）；BP211D電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；Seven Easy pH計(jì)（上海精密儀器科學(xué)儀器有限公司）。

甲硝唑氯化鈉注射液，規(guī)格：100mL；甲硝唑100mg與氯化鈉0.8g，江蘇長(zhǎng)江藥業(yè)有限公司，批號(hào)：120107、120527、121002；乙腈為色譜純（美國(guó)Tedia公司），乙二胺四乙酸二鈉磷酸、10%四丁基氫氧化銨溶液及其他試劑均為分析純。

2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

附圖 對(duì)照品、樣品、陰性對(duì)照?qǐng)D譜

附表1 EDTA線性關(guān)系

附表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent C18（150mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈∶緩沖液（10%四丁基氫氧化銨溶液6mL，加水稀釋至200mL，以磷酸調(diào)節(jié)pH值為6.5）∶水（20∶20∶60），檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，流速為1.0mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量為20μL。

3 溶液的制備

3.1 對(duì)照品溶液 精密稱取EDTA適量，加水使溶解并定量稀釋成0.5g/L的EDTA溶液，精密吸取5mL置50mL量瓶中，加1%硫酸銅溶液10mL，加水稀釋至刻度，搖勻，以0.45μm的微孔濾膜濾過(guò)，即得。

3.2 供試品溶液 精密量取甲硝唑氯化鈉注射液適量（相當(dāng)于EDTA 2.5mg），置50mL量瓶中，加水適量使溶解，加1%硫酸銅溶液10mL，加水稀釋至刻度，搖勻，以0.45μm的微孔濾膜濾過(guò)，即得。

3.3 空白溶液 精密稱取不含EDTA的空白制劑適量（相當(dāng)于EDTA 2.5mg），置50mL量瓶中，加水適量使溶解，加1%硫酸銅溶液10mL，加水稀釋至刻度，搖勻，以0.45μm的微孔濾膜濾過(guò)，即得。

附表3 EDTA重復(fù)性試驗(yàn)

附表4 EDTA加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

4 方法與結(jié)果

4.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密稱取EDTA空白溶液、供試品溶液及對(duì)照品溶液各20μL，分別記錄色譜圖，結(jié)果表明EDTA峰的理論塔板數(shù)為2000左右，甲硝唑與EDTA的分離度良好，見附圖。

4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取0.5g/L的EDTA溶液0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0mL分別置50mL容量瓶中，加1%硫酸銅溶液10mL，用水稀釋至刻度，搖勻，0.45μm的微孔濾膜濾過(guò)并精密量取續(xù)濾液20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖以EDTA進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程：Y＝53653.7645X－1486.1658，r＝0.9998，結(jié)果表明：EDTA進(jìn)樣量在0.1～2.0μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，見附表1。

4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（120107）的供試品溶液，精密吸取20μL，每間隔一定時(shí)間進(jìn)樣，測(cè)定，以峰面積考察。EDTA的RSD分別為0.93%，結(jié)果表明，供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定，說(shuō)明本方法有良好的穩(wěn)定性，見附表2。

4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的甲硝唑氯化鈉注射液（批號(hào)：120107）6份，按含量測(cè)定方法項(xiàng)下平行試驗(yàn)，測(cè)定其含量，結(jié)果EDTA的平均含量別為4.20，重復(fù)性試驗(yàn)RSD分別為1.46%，見附表3。

4.5 加樣回收率試驗(yàn) 稱取3批已知含量的樣品，每批做三份（批號(hào)：120107、120527、121002），精密稱定，分別精密加入對(duì)照品適量，按上述方法制備供試品溶液，測(cè)定其含量，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，EDTA平均回收率為98.11%；RSD為1.06%，見附表4。

4.6 樣品測(cè)定 精密量取本品適量（相當(dāng)于EDTA2.5mg），置50mL量瓶中，加水適量，加1%的硫酸銅溶液10mL，加水稀釋至刻度，搖勻，以0.45μm的微孔濾膜濾過(guò)，精密量取20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，另精密稱取EDTA25mg，置50mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取5mL置50mL量瓶中，加1%的硫酸銅溶液10mL，加水稀釋至刻度，搖勻，以0.45μm的微孔濾膜濾過(guò)，同法測(cè)定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

4.7 檢測(cè)下限考察 取EDTA溶液（0.51mg/mL）1mL置10mL容量瓶中制成混合液[1]，取混合液依次稀釋至1000倍時(shí)，信噪比（S/N）約為10，檢測(cè)限濃度分別約為0.51μg/mL。

5 討論

由于EDTA易與金屬離子絡(luò)合，在色譜柱中會(huì)與色譜柱不銹鋼表面發(fā)生絡(luò)合，導(dǎo)致其相應(yīng)值變低、峰形嚴(yán)重拖尾。本法采用硫酸銅溶液，使EDTA和銅離子形成比較穩(wěn)定的絡(luò)合物，避免發(fā)生作用。研究表明，1%的硫酸銅溶液的用量為10mL時(shí)，EDTA的峰形較好，故本法采用1%的硫酸銅溶液的用量為10mL作為反應(yīng)濃度。在加硫酸銅溶液進(jìn)行反應(yīng)時(shí)溶液會(huì)發(fā)生混濁，因此在反應(yīng)完加到刻度后，用0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾，防止堵塞和污染色譜柱，且可降低對(duì)EDTA測(cè)定的干擾作用。故采用本法測(cè)定甲硝唑氯化鈉注射液中EDTA的含量，分離度好。