模擬失重大鼠胰腺組織HSP70表達的變化

劉飛 周金蓮 段育忠 張詩琳 楊建武 楊鶴鳴 李成林 崔彥

·論著·

模擬失重大鼠胰腺組織HSP70表達的變化

劉飛 周金蓮 段育忠 張詩琳 楊建武 楊鶴鳴 李成林 崔彥

目的研究模擬失重環(huán)境下大鼠胰腺組織HSP70表達的變化。方法健康雄性Wistar大鼠64只，采用尾懸吊法建立模擬失重動物模型。按完全隨機法分為懸尾6、12 h及1、2、3、5、7 d組和未懸尾對照組。應(yīng)用免疫組化法、蛋白質(zhì)印跡法和RT-PCR法檢測各組大鼠胰腺組織HSP70蛋白和mRNA的表達。結(jié)果免疫組化染色顯示，對照組大鼠胰腺組織無HSP70蛋白表達，懸尾組大鼠胰腺組織均有HSP70蛋白表達，尤其是胰島細胞的胞質(zhì)和胞核在早期即深染。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，懸尾6、12 h及1、2 d組大鼠胰腺組織HSP70蛋白持續(xù)高表達，分別為0.921±0.078、0.862±0.048、0.838±0.063、0.807±0.071，較對照組的0.693±0.055顯著增加(P<0.05)；3、5、7 d組的HSP70蛋白表達恢復到對照組水平。HSP70 mRNA表達在6 h組即明顯增加至0.881±0.013，然后逐漸回落，3 d組降至0.694±0.027，5 d組出現(xiàn)回升，達0.836±0.014，7 d組又回落至0.674±0.013。結(jié)論模擬失重使大鼠胰腺組織中HSP70蛋白和mRNA表達發(fā)生明顯變化，早期過表達，后期恢復正常水平。

失重模擬； 胰腺； HSP70熱休克蛋白質(zhì)類； 大鼠

隨著宇宙探測活動的日益頻繁和空間技術(shù)的迅速發(fā)展，對于失重狀態(tài)下航天員身體各器官系統(tǒng)變化的研究顯得愈加重要。胰腺作為人體最大的消化和內(nèi)分泌器官之一，了解失重對其功能及結(jié)構(gòu)影響的意義十分重大。然而國內(nèi)外在這方面的研究報道相對較少[1-3]。本研究檢測模擬失重環(huán)境下大鼠胰腺組織中誘導型熱休克蛋白70(heat shock protein，HSP70)的表達，探討胰腺組織對失重的應(yīng)激反應(yīng)特點，為航天員訓練和飛行的醫(yī)療保障提供參考依據(jù)。

材料與方法

一、實驗動物與分組

清潔級健康成年雄性Wistar大鼠64只，平均體重(300±50) g，由中國農(nóng)業(yè)大學動物實驗研究所提供。飼養(yǎng)條件為人工控溫(22±2)℃，每12 h晝夜循環(huán)，自由飲水采食。經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

采用尾吊法建立模擬失重模型[4]，即將大鼠尾部吊起，頭體下懸，前肢著地，后肢完全解除負荷，與地面成30°，可以自由活動。按數(shù)字表法隨機分為懸尾6、12 h及1、2、3、5、7 d組，并以未懸尾作為對照組，每組8只。實驗結(jié)束時，腹腔注射水合氯醛(300 mg/kg體重)麻醉大鼠，無菌操作，經(jīng)腹正中線剖腹，取胰尾組織保存于-80°冰箱中，胰頭組織浸于4%多聚甲醛(pH7.4)固定，常規(guī)石蠟包埋。

二、大鼠胰腺組織HSP70蛋白檢測

取各組石蠟包埋的胰腺組織，常規(guī)切片，采用免疫組化法檢測胰腺組織HSP70蛋白表達?？笻SP70單抗購自美國Novus Biologicals，Biolab，生物素標記的羊抗鼠IgG及辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素購自美國Zymed公司，最后 DAB顯色，復染，脫水，透明，封片。鏡下見胞核和(或)胞質(zhì)中有明顯的棕黃色顆粒為HSP70表達陽性。

另取凍存的新鮮胰腺組織，在液氮預冷的研缽中研碎，加入組織裂解液(含蛋白酶抑制劑)置冰上20 min，低溫下12 000 r/min離心15 min，取上清。Bradford法定量蛋白后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測HSP70蛋白表達，最后ECL發(fā)光，暗室內(nèi)顯影。以 GAPDH作為內(nèi)參。應(yīng)用AlphaImager 2200 軟件分析條帶的吸光值，以HSP70條帶與GAPDH條帶的吸光值比值表示蛋白表達量。

三、大鼠胰腺組織HSP70 mRNA檢測

根據(jù)Genebank設(shè)計引物序列。HSP70上游引物5′-ATCATCTCAACGAGCCACAG-3′，下游引物5′-ACAGGTCCGAGCACAGCT-3′，擴增片段415 bp；GAPDH上游引物5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，下游引物5′-GGGTGGTCCAGGGTTTCTTA-3′，擴增片段186 bp。 取凍存胰腺組織放入研磨器中研磨，按100 mg粉末加入1 ml Trizol提取總RNA，采用RT-PCR法檢測HSP70mRNA的表達。PCR條件：94℃ 5 min，95℃ 10 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，39個循環(huán)，72℃延伸10 min。以GAPDH為內(nèi)參。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離，用電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)進行灰度掃描，以目的條帶與GAPDH條帶的灰度比值表示HSP70 mRNA的表達量。

四、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、實驗動物一般情況

本實驗過程順利，無大鼠死亡。懸吊第1天，大鼠煩躁不安，精神萎靡，排泄物增多，飲食較對照組減少，2 d以后各組大鼠逐漸恢復平靜，飲食、飲水逐漸正常。

二、胰腺組織HSP70蛋白表達

免疫組化結(jié)果顯示，對照組大鼠腺泡細胞和胰島細胞均未見著色(圖1a)。懸尾各組大鼠胰腺組織均有HSP70陽性表達，表現(xiàn)為胞質(zhì)和胞核呈棕褐色。在懸吊6 h～2 d期間，腺泡細胞HSP70蛋白表達量隨懸吊時間延長而增加，表現(xiàn)為胞質(zhì)染色逐漸加深，胰島細胞在模擬失重早期即過表達，表現(xiàn)為胞質(zhì)深染(圖1b～d)；懸吊3～5 d組大鼠胰腺組織的HSP70蛋白表達逐漸下降，染色逐漸變淺。

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，各組大鼠胰腺組織均有HSP70蛋白表達(圖2)。懸吊6 h組HSP70蛋白表達水平最高，并持續(xù)高表達達2 d，均較對照組顯著升高(P值均<0.05)；懸吊3 d后HSP70蛋白表達下降，3、5、7 d時的HSP70表達水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(表1)。

三、胰腺組織HSP70 mRNA的表達

各組大鼠胰腺組織中均有HSP70 mRNA表達(圖3)，表現(xiàn)為早期上升后期回落的特征。模擬失重6 h大鼠胰腺組織HSP70 mRNA表達水平即升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。12 h及1、2、3 d組的HSP70 mRNA表達逐漸回落，但5 d組出現(xiàn)回升，7 d組又降至正常水平(表1)。

圖1對照組(a)及尾懸吊12 h(b)、1d(c)、2 d(d)大鼠胰腺組織的HSP70表達(免疫組化 ×400)

1：對照組；2～3：懸尾6、12 h組；4～8：懸尾1、2、3、5、7 d組

組別只數(shù)mRNA表達量蛋白表達量對照組80．675±0．0160．693±0．055懸尾6h組80．881±0．013a0．921±0．078a 12h組80．874±0．014a0．862±0．048a 1d組80．865±0．014a0．838±0．063a 2d組80．837±0．012a0．807±0．071a 3d組80．694±0．0270．691±0．059 5d組80．836±0．014a0．633±0．062 7d組80．674±0．0130．604±0．069

注：與對照組比較，aP<0.05

1：對照組；2～3：懸尾6、12 h組；4～8：懸尾1、2、3、5、7 d組

討 論

HSP70是進化上高度保守的一種特殊應(yīng)激蛋白質(zhì)，具有分子伴侶作用。正常情況下，HSP70在細胞質(zhì)較低表達。多種不良刺激，如熱刺激、缺血、缺氧、過氧化、低血糖、紫外線、γ射線、外傷、病毒和細菌感染以及某些化學物質(zhì)(乙醇、亞砷酸鈉、砒霜)中毒[5-7]等均可誘導細胞胞核中HSP70蛋白在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)迅速增加，聚集核內(nèi)并包圍核仁。一但刺激消除或?qū)Υ碳みm應(yīng)后，組織細胞便進入應(yīng)激恢復期，胞核中HSP70表達減少甚至中止，但胞質(zhì)中仍有低水平表達。HSP70在應(yīng)激過程中的轉(zhuǎn)錄、表達和調(diào)控機制尚未完全清楚[6-7]。

相關(guān)研究表明，失重狀態(tài)及其一系列連鎖反應(yīng)亦屬于對機體的特殊刺激[8-9]。失重作為一種特殊的應(yīng)激原，同樣可能引起HSP70表達水平發(fā)生變化。Ohnishi等[9]報道，搭乘NASA航天飛行器的金魚對微重力及空間輻射產(chǎn)生分子水平的應(yīng)激誘導反應(yīng)，多個臟器的HSP72水平明顯升高。劉春等[10]在大鼠心肌、血管組織的模擬失重實驗研究中發(fā)現(xiàn)，失重本身并不誘導大鼠心肌組織表達HSP70，但可誘導大鼠腦血管HSP70表達增加，而后肢血管的HSP70表達則下降。Ding等[11]進行為期2個月的模擬失重研究，發(fā)現(xiàn)模擬失重環(huán)境中大鼠腎臟HSP70過表達，對抗訓練能減少腎臟細胞凋亡，降低腎組織HSP70表達，進而減輕失重造成的腎臟損傷。崔彥等[12]研究發(fā)現(xiàn)，HSP70蛋白和mRNA在模擬失重大鼠肝組織中的表達表現(xiàn)為應(yīng)激早期升高、后期下降的特征。而失重情況下胰腺組織中HSP70表達的相關(guān)研究尚未見文獻報道。

本研究結(jié)果顯示，尾懸吊模擬失重導致實驗大鼠胰腺組織尤其胰島細胞中HSP70蛋白表達發(fā)生明顯變化，胰島細胞核在模擬失重早期即出現(xiàn)深染，說明失重對胰島細胞的結(jié)構(gòu)和功能造成一定影響，這與文獻報道以及筆者前期研究發(fā)現(xiàn)失重大鼠血清胰島素短期內(nèi)升高、血糖波動明顯的特點相符[13-16]。腺泡細胞的染色變化不及胰島細胞，亦與筆者前期研究發(fā)現(xiàn)血清淀粉酶和脂肪酶在模擬失重過程中僅呈一過性升高的特點有一定類同性[16]。顯然，HSP70在胰腺的失重應(yīng)激反應(yīng)過程中發(fā)揮了重要作用，但具體機制和胰腺組織中各種類型細胞對模擬失重的各自反應(yīng)特點，尤其失重環(huán)境下胰島β細胞的功能變化和胰島素的代謝特性及機制尚需做深入的研究。

本研究結(jié)果還表明，大鼠胰腺組織中HSP70蛋白和mRNA的表達水平在尾懸吊早期即同步顯著上升，提示模擬失重是一種能誘導胰腺組織細胞表達HSP70的特殊而典型的應(yīng)激原。HSP70表達于模擬失重6 h形成高峰之后逐漸回落，其中HSP70 mRNA下降速度較快，幅度較大，而HSP70蛋白表達水平回落較慢，接近正常范圍時趨于穩(wěn)定。我們認為，這一方面符合HSP70基因激活轉(zhuǎn)錄優(yōu)先并指令蛋白合成的規(guī)律，同時有可能存在HSP70 mRNA上下游基因信號調(diào)控的特殊機制。HSP70早期急劇升高、后期逐漸回落的現(xiàn)象表明其不但具有雙刃劍樣作用，還具有交叉耐受特性及記憶功能，其表達過程及水平與組織細胞應(yīng)激損傷和自身保護機制密切相關(guān)，同時HSP70形成的應(yīng)激耐力無特異性[6-7,17]。根據(jù)文獻和本研究結(jié)果推測，HSP70在胰腺的失重應(yīng)激損傷與失重應(yīng)激耐受或適應(yīng)過程中可能發(fā)揮重要作用，失重及非失重應(yīng)激原誘導HSP70表達均應(yīng)能提高失重應(yīng)激耐力，此機制的詮釋在失重訓練和航天飛行中可能有重要意義。

[1] Blaber E, Marcal H, Burns BP.Bioastronautics:the influence of microgravity on astronaut health.Astrobiology,2010,10:463-473.

[2] Williams D, Kuipers A, Mukai C, et al. Acclimation during space flight: effects on human physiology. CMAJ, 2009, 180:1317-1323.

[3] 郭英華,劉長庭.空間生命科學研究與展望.解放軍醫(yī)學雜志,2011,36:416-417.

[4] 陳杰,馬進,丁兆平,等.一種模擬長期失重影響的大鼠尾部懸吊模型.空間科學學報,1993,2:159-162.

[5] El Golli-Bennour E, Bacha H. Hsp70 expression as biomarkers of oxidative stress: mycotoxins′ exploration. Toxicology, 2011,287:1-7.

[6] Silver JT, Noble EG. Regulation of survival gene hsp70. Cell Stress Chaperones, 2012,17:1-9.

[7] Young JC. Mechanisms of the Hsp70 chaperone system. Biochem Cell Biol, 2010, 88:291-300.

[8] Cotrupi S, Maier JA. Is Hsp70 upregulation crucial for cellular proliferative response in simulated microgravity? J Gravit Physiol, 2004, 11:173-176.

[9] Ohnishi T, Tsuji K, Ohmura T, et al. Accumulation of stress protein 72 (HSP72) in muscle and spleen of goldfish taken into space. Adv Space Res, 1998, 21:1077-1080.

[10] 劉春,張立藩,余志斌,等. 模擬失重大鼠心肌與血管組織的熱應(yīng)激誘導Hsp70表達. 生理學報, 2001, 53:123-127.

[11] Ding Y, Zou J, Li Z, et al. Study of histopathological and molecular changes of rat kidney under simulated weightlessness and resistance training protective effect. PLoS One, 2011, 6:e20008.

[12] 崔彥,董家鴻,周金蓮,等. 模擬失重對大鼠肝臟Hsp70及其基因表達的影響. 中華肝膽外科雜志, 2009,15:594-597.

[13] Macho L, Fickova M, Nemeth S, et al. The effect of space flight on the board of the satellite cosmos 2044 on plasma hormone levels and liver enzyme activities of rats. Acta astronaut, 1991, 24:329-332.

[14] Miyake M, Yamasaki M, Hazama A, et al. Effects of microgravity on organ development of the neonatal rat. Biol Sci Space, 2004, 18:126-127.

[15] Song C, Duan XQ, Li X, et al. Experimental study of rat beta islet cells cultured under simulated microgravity conditions. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai)， 2004, 36:47-50.

[16] 劉飛,周立艷,李成林,等. 模擬失重對大鼠胰腺分泌功能的影響. 醫(yī)學研究雜志, 2012, 20:42-44.

[17] Chen T, Cao X. Stress for maintaining memory: Hsp70 as a mobile messenger for innate and adaptive immunity. Eur J Immunol, 2010, 40:1541-1544.

(本文編輯：呂芳萍)

歡迎訂閱《中華胰腺病雜志》

HSP70expressioninpancreasofratsundertheconditionofsimulatedweightlessness

LIUFei,ZHOUJin-lian,DUANYu-zhong,ZHANGShi-lin,YANGJian-wu,YANGHe-ming,LICheng-lin,CUIYan.

DepartmentofGeneralSurgery,The306HospitalofPLA,Beijing100101,China

CUIYan,Email：dryancui@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate Hsp70 expression features of rat′s pancreas under the condition of simulated weightlessness.MethodsTail-suspension method was used to simulate the weightlessness animal model. Sixty four adult male Wistar rats were randomly divided into 8 experimental groups (n=8)：suspended for 6 h, 12 h, 1 d, 2 d, 3 d, 5 d, 7 d and control group. Hsp70 protein and mRNA in rat′s pancreas were detected by using immunohistochemical assay, Western blot and RT-PCR techniques.ResultsThe immunohistochemistry assay showed that Hsp70 protein was expressed in rats with tail-suspension, in particular the nuclei and cytoplasm of pancreatic islet cells were deeply stained in the early phase of suspension, but was not expressed in rats without tail-suspension. The expressions of Hsp70 protein were 0.881±0.013, 0.874±0.014, 0.865±0.014, 0.837±0.012 in 6 h, 12 h, 1 d, 2 d groups, which were significantly higher than those in control group (0.921±0.078,P<0.05)，and 0.862±0.042, 0.838±0.063, 0.807±0.071 in 3 d,5 d,7 d groups, which returned to the level of control group. The expressions of Hsp70 mRNA significantly increased at 6 h, and then gradually decreased, at 3 d they reached the lowest point (0.694±0.027), and they began to increase to 0.836±0.014 at 5 d and decrease to 0.674±0.013 at 7 d.ConclusionsThe simulated weightlessness has remarkable effect on the expressions of Hsp70 protein and mRNA in rat′s pancreas, and the expressions are up-regulated in the early phase and returns to normal level in the late phase.

Weightlessness simulated； Pancreas； HSP70 heat-shock proteins； Rat

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.01.009

全軍醫(yī)學科研“十一五”后勤科研攻關(guān)項目(08G058)；全軍醫(yī)學科研“十二五”重點項目(BWS11J051)

100101 北京，解放軍第306醫(yī)院普通外科(劉飛、段育忠、張詩琳、楊建武、楊鶴鳴、李成林、崔彥)，病理科(周金蓮)

崔彥，Email:dryancui@yahoo.com.cn

2012-09-26)