MMI-166對(duì)人胰腺癌SW1990細(xì)胞凋亡及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

高崇崇 鞏本剛 夏修良 宋德坤 徐懷勇

·論著·

MMI-166對(duì)人胰腺癌SW1990細(xì)胞凋亡及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

高崇崇 鞏本剛 夏修良 宋德坤 徐懷勇

目的觀察MMI-166對(duì)人胰腺癌SW1990細(xì)胞及其移植瘤組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討其可能機(jī)制。方法應(yīng)用人胰腺癌細(xì)胞株SW1990建立裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型，按完全隨機(jī)法將荷瘤裸鼠分為對(duì)照組和MMI-166組，分別給予口服生理鹽水和MMI-166(200 mg·kg-1·d-1)，持續(xù)28 d。采用TUNEL法和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)移植瘤組織的細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)及p53、c-Myc、Bax、Bcl-2、Survivin、Caspase-1、Fas蛋白的表達(dá)。應(yīng)用不同濃度(0、50、100 μg/ml)MMI-166作用于人胰腺癌SW1990細(xì)胞24 h，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)c-Myc、Survivin的表達(dá)。結(jié)果MMI-166組移植瘤組織的AI為81.1±7.9，顯著高于對(duì)照組的21.3±2.2(P=0.000)；c-Myc、Survivin的表達(dá)量分別為7715±2229、4594±1240，顯著低于對(duì)照組的16870±2446、15208±1903(P值均為0.000)；p53、Bax、Bcl-2、Caspase-1、Fas的表達(dá)與對(duì)照組比較無(wú)顯著變化。50、100 μg/ml的MMI-166處理后，人胰腺癌SW1990細(xì)胞的c-Myc表達(dá)量顯著下調(diào)(0.098±0.003、0.073±0.008比0.169±0.007，F(xiàn)=189.361，P<0.05)；Survivin的表達(dá)量無(wú)明顯變化。結(jié)論MMI-166可能通過(guò)下調(diào)c-Myc的表達(dá)誘導(dǎo)人胰腺癌SW1990細(xì)胞凋亡。

胰腺腫瘤； MMI-166； 金屬蛋白酶類組織抑制劑； 細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡減少已被證實(shí)是多種腫瘤致病機(jī)制之一[1]，研究細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)于人們認(rèn)識(shí)腫瘤發(fā)病機(jī)制及新的防治方法具有重要意義。MMI-166是第三代新型基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)抑制劑，可選擇性抑制MMP-2、MMP-9的活性。我們前期的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MMI-166在體外呈濃度及時(shí)間依賴性促進(jìn)人胰腺癌SW1990細(xì)胞凋亡[2]。本研究進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察MMI-166對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討MMI-166與c-Myc、Survivin表達(dá)的量效關(guān)系。

材料與方法

一、人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立

BALB/c裸鼠20只，4～5周齡，雄性，體重18～22 g，購(gòu)自上海斯萊克動(dòng)物中心，在無(wú)特定病原體動(dòng)物(SPF)條件下飼養(yǎng)。人胰腺癌SW1990細(xì)胞株購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用無(wú)血清L-15培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度，按1×107/只密度接種于裸鼠背部皮下。約7 d后裸鼠背部均有移植瘤生長(zhǎng)，成瘤率100%。按完全隨機(jī)法將裸鼠分成對(duì)照組及MMI-166組。對(duì)照組裸鼠口服生理鹽水，MMI-166組裸鼠口服MMI-166 200 mg·kg-1·d-1(日本SHIONOGI公司免費(fèi)提供)，連服28 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死裸鼠，取移植瘤標(biāo)本，用10%中性甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片。

二、免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)p53、c-Myc、Bax、Bcl-2、Survivin、Caspase-1、Fas蛋白

p53、c-Myc、Bax、Bcl-2、Survivin、Caspase-1、Fas抗體均購(gòu)自福州邁新公司，二抗購(gòu)自PAKD公司，每種抗體重復(fù)檢測(cè)3次。隨機(jī)取10個(gè)100倍視野，應(yīng)用Image-pro Plus6.0軟件計(jì)算吸光值，取均值表示蛋白表達(dá)量。

三、細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)檢測(cè)

采用TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞，試劑盒購(gòu)自德國(guó)羅氏公司，按說(shuō)明書(shū)操作。細(xì)胞核中出現(xiàn)深棕色為凋亡細(xì)胞。每例切片至少計(jì)數(shù)10個(gè)400倍視野，以平均每1000個(gè)細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為AI值。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)陰性對(duì)照片(即加不含TdT酶的反應(yīng)液)和陽(yáng)性對(duì)照片(DNA內(nèi)切酶預(yù)處理過(guò)的組織切片)。

四、c-Myc、Survivin蛋白表達(dá)檢測(cè)

應(yīng)用0、50、100 μg/ml的MMI-166處理SWl990細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，應(yīng)用細(xì)胞裂解液裂解。蛋白定量后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)c-Myc、Survivin表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參，應(yīng)用ImageJ軟件分析。以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值表示蛋白表達(dá)量。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、裸鼠移植瘤組織的凋亡指數(shù)

凋亡細(xì)胞的胞核呈深棕色，染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解。凋亡細(xì)胞呈單個(gè)散在分布和(或)簇狀分布(圖1)。MMI-166組移植瘤的AI為81.1±7.9，顯著高于對(duì)照組的21.3±2.2(P=0.000)。

圖1對(duì)照組(a)及MMI-166組(b)的凋亡細(xì)胞(TUNEL法 ×100)

二、裸鼠移植瘤p53、c-Myc、Bax、Bcl-2、Survivin、Caspase-1、Fas的表達(dá)

Bax、Bcl-2、Survivin、Caspase-1定位于細(xì)胞質(zhì)，p53定位于細(xì)胞核，F(xiàn)as定位于細(xì)胞膜，c-Myc定位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)。MMI-166組移植瘤組織c-Myc、Survivin蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P值均<0.01)，而p53、Bax、Bcl-2、Caspase-1、Fas表達(dá)與對(duì)照組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2、表1)。裸鼠移植瘤組織c-Myc、Survivin表達(dá)與細(xì)胞凋亡呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.858，r=-0.939；P=0.000)。

圖2對(duì)照組(上)及MMI-166組(下)移植瘤組織c-Myc(a)、Survivin(b)、p53(c)、Fas(d)、Bax(e)、Bcl-2(f)及Caspase-1(g)蛋白表達(dá)(EnVision×100)

表1 兩組胰腺癌移植瘤c-Myc、Survivin、p53、Fas、Bax、Bcl-2、Caspase-1蛋白表達(dá)及

三、SW1990細(xì)胞c-Myc、Survivin蛋白的表達(dá)

對(duì)照組SW1990細(xì)胞的c-Myc、Survivin蛋白表達(dá)量分別為0.169±0.007和0.391±0.006。50、100 μg/ml的MMI-166處理SW1990細(xì)胞24 h后，c-Myc表達(dá)量分別為0.098±0.003、0.073±0.008，隨著藥物濃度增加表達(dá)量逐漸減少，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=189.361，P<0.05)；Survivin表達(dá)量分別為0.395±0.006、0.382±0.004，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.328,P>0．05,圖3)。

1：對(duì)照組，2：50 μg/ml MMI-166處理組；3．100 μg/ml MMI-166處理組

圖3各組SW1990細(xì)胞的c-Myc、Survivin表達(dá)

討 論

細(xì)胞凋亡又稱為程序性細(xì)胞死亡(PCD)，是多細(xì)胞生物體內(nèi)一種由生化調(diào)控引起的細(xì)胞自殺形式，它在組織分化、器官形成和抵御疾病方面起著重要的作用。細(xì)胞凋亡的途徑主要有兩條，一條是通過(guò)胞外信號(hào)激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡酶caspase，一條是通過(guò)線粒體釋放凋亡酶激活因子激活caspase。這些活化的caspase可將細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白降解，引起細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡的調(diào)控涉及許多基因，包括一些與細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)的原癌基因和抑癌基因，其中研究較多的有p53、c-Myc、Bax、Bcl-2、Survivin、Caspase-1、Fas等。本研究結(jié)果顯示，MMI-166處理組移植瘤的細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著高于對(duì)照組，表明MMI-166在體內(nèi)具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。

文獻(xiàn)報(bào)道，c-Myc是一類“快速早期反應(yīng)”的細(xì)胞內(nèi)信使，其表達(dá)使細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，在某些生長(zhǎng)因子的刺激下促使細(xì)胞增殖[3]。李勝等[4]研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)胰腺癌和胰腺癌轉(zhuǎn)移瘤組織中c-Myc的表達(dá)明顯高于胰腺良性病變組織。Orian等[5]研究了62例腦星形細(xì)胞瘤，發(fā)現(xiàn)低、中、高度惡性腫瘤組織的c-Myc蛋白過(guò)表達(dá)率分別為5%、33%和76%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。他們認(rèn)為c-Myc蛋白高表達(dá)意味著有相當(dāng)高比例的細(xì)胞處于增殖狀態(tài)，而凋亡受抑制是腫瘤進(jìn)展的重要指標(biāo)，患者預(yù)后極差。Survivin是凋亡抑制蛋白(IAP)中分子質(zhì)量最小和最具有基礎(chǔ)與臨床意義而倍受關(guān)注的分子。Sarela等[6]報(bào)道，52例胰腺癌組織的Survivin陽(yáng)性率為88%，Survivin陽(yáng)性時(shí)凋亡指數(shù)低，而凋亡指數(shù)低的患者預(yù)后明顯差于凋亡指數(shù)高的患者。推測(cè)細(xì)胞凋亡的增加與c-Myc、Survivin的表達(dá)下降有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，MMI-166處理人胰腺癌SW1990細(xì)胞24 h后c-Myc的表達(dá)下調(diào)，而Survivin的表達(dá)無(wú)明顯變化，推測(cè)MMI-166促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡與c-Myc基因表達(dá)下調(diào)有關(guān)。Survivin表達(dá)雖無(wú)明顯變化，但不排除樣本量及蛋白濃度等因素的影響，因此MMI-166對(duì)Survivin表達(dá)的影響仍需進(jìn)一步研究。

Meyer等[7]報(bào)道，MMP-9和MMP-10保護(hù)結(jié)腸腺癌細(xì)胞免于PKC/p53誘導(dǎo)的凋亡。Chetty等[8]報(bào)道，MMP-2可以通過(guò)改變Bax/Bcl-2表達(dá)，誘導(dǎo)Caspase-3、8、9以及PARP-1分裂體形成，誘導(dǎo)Fas/FasL的活化等途徑抑制肺腺癌細(xì)胞的凋亡。由于MMI-166抑制MMP-2、MMP-9的活性[9]，提示MMI-166可能通過(guò)抑制MMP-2、9表達(dá)而下調(diào)c-Myc的表達(dá)，從而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡，但其具體機(jī)制待進(jìn)一步研究。

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(本文編輯：呂芳萍)

EffectsofMMI-166onapoptosisandapoptosis-relatedproteinexpressioninhumanpancreaticcancerSW1990cells

GAOChong-chong,GONGBen-gang,XIAXiu-liang,SONGDe-kun,XUHuai-yong.

BinzhouMedicalCollege;DepartmentofHepatobiliarySurgery,BinzhouPeople′sHospital,BinzhouMedicalCollege,Binzhou256600,ChinaCorrespongdingauthor:GONGBen-gang,Email：shenglixiyuan@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of MMI-166 on apoptosis and apoptosis-related protein expression of human pancreatic cancer SW1990 cells and its transplanted tumor, and explore possible mechanism.MethodsThe human pancreatic cancer xenograft model was constructed by using human pancreatic cancer SW1990 cells. Tumor-bearing nude mice were randomly divided into control and MMI-166 groups, and they were treated with normal saline or MMI-166 (200 mg·kg-1·d-1) for 28 days. Apoptosis index (AI), p53, c-Myc, Bax, Bcl-2, Survivin, Caspase-1, Fas proteins were detected by deoxynucl-eotidyl transferase-mediated nick end labeling (TUNEL method) and Western blot. MMI-166 of different concentrations (0, 50, 100 μg/ml) were used to treat human pancreatic cancer SW1990 cell for 24 h. The c-Myc, Survivin proteins expressions were measured by Western blotting.ResultsApoptosis index in MMI-166 group was 81.1±7.9, which was significantly higher than that in control group (21.3±2.2,P=0.000); the expressions of c-Myc, Survivin were 7715±2229, 4594±1240, which were significantly higher than those in control group (16870±2446, 15208±1903,P=0.000); the expressions of p53, Bax, Bcl-2, Caspase-1, Fas were not significantly different from those in control group. After 50, 100 μg/ml MMI-166 treatment, the expression of c-Myc was significantly down-regulated (0.098±0.003, 0.073±0.008vs. 0.169±0.007,F=189.361,P<0.05); and the expression of Survivin was not significantly changed.ConclusionsMMI-166 may induce cell apoptosis of SW1990 by down-regulating the expression of c-Myc.

Pancreatic neoplasm; MMI-166; Tissue inhibitor of metalloproteinases; Apoptosis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.01.008

濱州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目

256600 山東，濱州醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院(高崇崇、宋德坤)；濱州醫(yī)學(xué)院附屬濱州市人民醫(yī)院肝膽外科(鞏本剛、夏修良、徐懷勇)

鞏本剛，Email：shenglixiyuan@163.com

2012-09-13)