Delta-like 4在胰腺癌中的表達(dá)及其意義

張偉杰 徐桂芳 周志華 田志強(qiáng) 鄒曉平

·論著·

Delta-like 4在胰腺癌中的表達(dá)及其意義

張偉杰 徐桂芳 周志華 田志強(qiáng) 鄒曉平

目的檢測(cè)Delta-like 4(DLL4)在胰腺癌中的表達(dá)，探討其臨床意義。方法采用免疫組化法檢測(cè)60例胰腺癌組織中DLL4的表達(dá)，行血管內(nèi)皮特異性標(biāo)志物CD34免疫染色，計(jì)算微血管密度(MVD)；分析它們的相關(guān)性及其與胰腺癌臨床病理特征、患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果DLL4在胰腺癌組織中的表達(dá)明顯高于正常胰腺組織(68.3%比20.0%,χ2=14.239,P<0.01)，其高表達(dá)與胰腺癌的腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及累及范圍密切相關(guān)，與腫瘤大小、部位、病理分型無(wú)關(guān)。胰腺癌組織MVD明顯高于正常胰腺組織(34.9±13.2比18.9±2.2,t=3.570,P<0.01)，其與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及累及范圍密切相關(guān)，與腫瘤大小、部位及病理分型無(wú)關(guān)。DLL4陽(yáng)性表達(dá)與預(yù)后密切相關(guān)。經(jīng)Cox模型分析，TNM分期、DLL4陽(yáng)性表達(dá)是胰腺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)論DLL4的高表達(dá)在胰腺癌轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)中起重要作用。腫瘤DLL4表達(dá)和TNM分期對(duì)評(píng)估胰腺癌患者的預(yù)后有一定價(jià)值。

胰腺腫瘤； Delta-like 4； 微血管密度； 免疫組織化學(xué)； 預(yù)后

Delta-like 4(DLL4)是哺乳動(dòng)物中一個(gè)主要與Notch1相互作用的Notch配體[1]，可以活化Notch信號(hào)，在腫瘤血管的新生、發(fā)育和成熟過(guò)程中起主要作用[2]。惡性膠質(zhì)瘤及前列腺癌的腫瘤細(xì)胞過(guò)表達(dá)DLL4，并促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)[3]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胰腺癌組織DLL4的表達(dá)及其與微血管密度(microvessel density, MVD)的關(guān)系，探討DLL4在判斷胰腺癌患者預(yù)后中的價(jià)值。

材料和方法

一、研究對(duì)象

收集南京鼓樓醫(yī)院2000年10月至2002年8月手術(shù)切除的60例胰腺癌標(biāo)本，其中男42例，女18例，年齡39～72歲，中位年齡63歲。取其中20例腫瘤邊緣處的正常胰腺組織作為對(duì)照。病理診斷與分類依據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)合會(huì)的TNM分類。

二、DLL4蛋白及MVD檢測(cè)

采用免疫組化染色法檢測(cè)組織DLL4的表達(dá)和MVD。兔抗人DLL4多抗購(gòu)自Abcam公司，工作濃度1∶10；兔抗人CD34多抗購(gòu)自福州邁新公司，工作濃度1∶100；鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶超敏試劑盒和二氨聯(lián)苯胺酶底物顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。用PBS替代一抗作空白對(duì)照。

每張切片由兩位病理醫(yī)師盲法分別讀片及評(píng)分。胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為DLL4陽(yáng)性染色。每張切片選取5個(gè)400倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性(-)，10%～25%為弱陽(yáng)性(+)，26%～50%為中度陽(yáng)性(++)，>50%為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。CD34表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜，每一個(gè)染成棕黃色的，可與周圍血管、腫瘤細(xì)胞及其他結(jié)締組織區(qū)分開(kāi)來(lái)的明顯微小血管腔或含3個(gè)以上內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞簇，不論管腔和紅細(xì)胞出現(xiàn)與否，均作為一個(gè)單一的可計(jì)數(shù)的微血管。管腔面積>8個(gè)紅細(xì)胞直徑、帶有較厚肌層的微血管均不計(jì)數(shù)[4]。先于低倍鏡下確定3個(gè)血管著色最密集區(qū)域，然后在200倍視野下計(jì)數(shù)微血管的數(shù)目，取均值作為MVD。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用log-rank檢驗(yàn)，影響預(yù)后因素采用多因素Cox回歸分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、胰腺癌組織DLL4表達(dá)及其與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系

胰腺癌組織DLL4的陽(yáng)性表達(dá)率為68.3%(41/60)，癌旁正常胰腺組織表達(dá)率為20.0%(4/20，圖1)，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.239，P<0.01)。胰腺癌組織DLL4表達(dá)與腫瘤分化程度、T分期、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與患者年齡、性別及腫瘤部位、大小、病理分型無(wú)關(guān)(表1)。

圖1 胰腺癌(a)和癌旁組織(b)的DLL4表達(dá)(×400)

二、胰腺癌組織MVD及其與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系

胰腺癌組織的MVD為34.9±13.2，癌旁正常胰腺組織為18.9±2.2(圖2)，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.570，P<0.01)。胰腺癌組織MVD與腫瘤分化程度、T分期、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與患者年齡、性別及腫瘤部位、大小、病理分型無(wú)關(guān)(表1)。

圖2 胰腺癌(a)和癌旁組織(b)的CD34表達(dá)(×400)

三、胰腺癌組織DLL4表達(dá)與MVD的關(guān)系

胰腺癌組織DLL4表達(dá)與MVD呈顯著正相關(guān)(r=0.669，P<0.05)。

表1 胰腺癌組織DLL4表達(dá)、MVD與臨床病理特征的關(guān)系

四、胰腺癌組織DLL4表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

60例患者隨訪截止日期為2004年1月。期間失訪3例，病死50例。 57例患者中位生存時(shí)間為301 d，1年生存率為30.5%(圖3a)。DLL4陰性患者的中位生存時(shí)間為569.5 d，1年生存率為66.7%；DLL4陽(yáng)性患者中位生存時(shí)間218 d，1年生存率為20.5%(圖3b)，DLL4陰性胰腺癌患者的預(yù)后明顯好于DLL4陽(yáng)性組患者(P<0.01)。

圖3 胰腺癌組織DLL4表達(dá)與患者生存關(guān)系

運(yùn)用Cox模型對(duì)可能影響患者預(yù)后的因素進(jìn)行分析，結(jié)果表明，DLL4表達(dá)量、TNM分期為影響胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素(表 2)。

表2 胰腺癌預(yù)后相關(guān)因素的多因素分析

討 論

DLL4是Notch信號(hào)通路中的一個(gè)重要配體，與腫瘤血管生成有關(guān)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中Notch信號(hào)通路包含了5種跨膜Notch配體(Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL3和DLL4)和4種Notch受體(Notch1～4)[1]。血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)Notch1和Notch4受體及jagged1、DLL1和DLL4配體。腫瘤血管和腫瘤細(xì)胞也高表達(dá)DLL4，可以活化Notch信號(hào)[5-6]。本研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織高表達(dá)DLL4，且與腫瘤組織MVD呈顯著正相關(guān)，與胰腺癌的浸潤(rùn)深度呈正相關(guān)，提示DLL4的過(guò)表達(dá)與胰腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。

抑制腫瘤組織中DLL4的過(guò)度表達(dá)將使腫瘤組織生成大量無(wú)功能的新生血管，造成腫瘤組織血供不足，最終導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)受到抑制[7-9]。Li等[10]報(bào)道，抗DLL4抗體可以特異性阻斷Notch信號(hào)通路，抑制腫瘤生長(zhǎng)，并減少腫瘤啟動(dòng)細(xì)胞的發(fā)生率。新近研究發(fā)現(xiàn)，特異性地阻斷DLL4信號(hào)通路能夠抑制胰腺癌腫瘤血管生成，進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)[11]。

MVD是衡量血管生成的定量指標(biāo)。MVD與多種腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移相關(guān)。Ikeda等[12]通過(guò)單因素和多因素研究認(rèn)為，MVD可作為影響胰腺癌預(yù)后的獨(dú)立因素。章福彬等[13]認(rèn)為，MVD與臨床病理特征關(guān)系密切，且與疾病進(jìn)展階段呈正相關(guān)。本結(jié)果顯示，胰腺癌組織MVD明顯升高，提示胰腺癌是一種血管豐富的惡性腫瘤。

本研究中，DLL4陽(yáng)性表達(dá)患者的中位生存時(shí)間明顯短于DLL4陰性患者，與Chen等[14]研究結(jié)果相似。

總之，DLL4的表達(dá)在胰腺癌的血管生成過(guò)程中起著重要作用，與胰腺癌的轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)密切相關(guān)，其表達(dá)可作為判斷胰腺癌預(yù)后的一個(gè)有意義指標(biāo)。

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(本文編輯：屠振興)

補(bǔ)充說(shuō)明

本刊2012(6)期“小型豬不同程度阻塞性慢性胰腺炎模型建立及其CT表現(xiàn)”一文作者單位：寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院影像科(汪建華)；第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科(汪建華、左長(zhǎng)京、張建、孫高峰、茅娟莉、潘桂霞、彭燁)，放射科(李曉棟)，病理科(鄭建明)；復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬華山醫(yī)院放射科(馮曉源)。通信作者：馮曉源：Email:cjr.fengxiaoyuan@vip.163.com。基金項(xiàng)目：上海市科委科研基金(10410708800)，中國(guó)博士后科學(xué)基金(20100480545)，浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012KYB176)，寧波市自然基金(2010A610052)。特此補(bǔ)充，順致歉意！

ExpressionandroleofDelta-like4inpancreaticcancer

ZHANGWei-jie,XUGui-fang,ZHOUZhi-hua,TIANZhi-qiang,ZOUXiao-ping.

DepartmentofScienceandTechnology,DrumTowerHospital,NanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing210008,China

ZOUXiao-ping,Email:zouxiaoping795@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the expression of Delta-like 4 (DLL4) in pancreatic cancer and its clinical significance.MethodsThe expression of DLL4 in pancreatic cancer was examined by immunohistochemistry method. The microvessel density (MVD) was calculated after CD34staining specifically for microvessel endothelium; and their correlations and relationship between them and clinicopathological parameters as well as prognosis of pancreatic carcinoma was investigated.ResultsThe expression of DLL4 in pancreatic cancer was significantly higher than that in normal pancreatic tissue (68.3%vs20%,P<0.01). The over-expression of DLL4 in pancreatic cancer was related to degree of differentiation, TNM staging, lymph node metastasis and invasion depth, while not related to the size, location and histological types. The MVD in pancreatic cancer tissues was notably higher than that in normal tissues (34.9±13.2vs18.9±2.2,P<0.01). MVD was correlated to degree of differentiation, lymph node metastasis, but not related to the size, location and histological types. DLL4 expression was closely associated with prognosis．COX model analysis showed that TNM staging and DLL4 expression were independent prognostic factors for pancreatic cancer.ConclusionsThe over-expressions of DLL4 may play an important role in metastasis and invasion of pancreatic cancer. Expression of DLL4 and TNM staging is useful for predicting the prognosis of patients with pancreatic cancer.

Pancreatic neoplasms； Delta-like 4； Microvessel density; Immunohischemistry； Prognosis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.01.007

南京大學(xué)中央高?？蒲匈Y助項(xiàng)目(021414340038)

210008 南京，南京大學(xué)附屬鼓樓醫(yī)院科技處(張偉杰)，消化內(nèi)科(徐桂芳、鄒曉平)；解放軍第101醫(yī)院病理科(周志華)，普外科(田志強(qiáng))

鄒曉平，Email:zouxiaoping795@hotmail.com

2012-04-06)