規(guī)?；i場藍(lán)耳病監(jiān)測技術(shù)分析報告

成仲庚

（湖南婁底職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南婁底417000）

1 前言

高致病性藍(lán)耳病（PPRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PPRSV）引起的以母豬繁殖障礙、仔豬和育成豬呼吸道癥狀為主要特征的一種高度接觸性傳染病，有高發(fā)病率、高死亡率、傳染速度快、耐過豬生長速度慢、成活率低等特點(diǎn)，因發(fā)病后豬兩耳出現(xiàn)短暫性的紫紺現(xiàn)象而稱為藍(lán)耳病。本病發(fā)生后常破壞豬的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致豬的抵抗力低下而容易繼發(fā)其它疾病如豬瘟、偽狂犬病、豬圓環(huán)病、豬細(xì)小病毒病、豬附紅體病、豬乙型腦炎等病，已成為影響和制約現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)正常發(fā)展的重要因素。

婁底及周邊地區(qū)是湖南主要的生豬生產(chǎn)基地，有數(shù)百家規(guī)?；B(yǎng)殖場及大量的散養(yǎng)戶，近年來，豬藍(lán)耳病、豬瘟、豬附紅體病及豬圓環(huán)病等疾病時有發(fā)生，給養(yǎng)豬來造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。然后，養(yǎng)殖場及散養(yǎng)戶對疫病普遍存在重免疫卻輕視免疫監(jiān)測的現(xiàn)象，有的養(yǎng)殖場年年免疫，年年發(fā)病，有的即使進(jìn)行了多次的強(qiáng)化免疫，效果卻差強(qiáng)人意。發(fā)生這些現(xiàn)象多與飼養(yǎng)管理不善、衛(wèi)生消毒工作不嚴(yán)格、免疫措施不合理，以及沒有進(jìn)行免疫結(jié)果監(jiān)測有關(guān)。本課題組通過對婁底及周邊地區(qū)

十個規(guī)?；B(yǎng)殖場的豬藍(lán)耳病免疫情況進(jìn)行調(diào)查及抗體監(jiān)測，分析了不同監(jiān)測技術(shù)的檢測效果。針對目前在規(guī)模化養(yǎng)殖場藍(lán)耳病預(yù)防存在的一些問題，我們提出了本病的預(yù)防應(yīng)該建立在免疫監(jiān)測抗體水平的基礎(chǔ)上進(jìn)行，即根據(jù)抗體水平高低采取針對性的措施。在免疫監(jiān)測上，選用了間接血凝試驗(yàn)和ELISA試紙法，對已免疫和未免疫的養(yǎng)殖場的各種豬采取血清進(jìn)行了對比試驗(yàn)。根據(jù)其檢測結(jié)果，對兩種監(jiān)測技術(shù)進(jìn)行分析，從而比較兩種監(jiān)測技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，為養(yǎng)殖場的抗體監(jiān)測和免疫提供依據(jù)。

2 材料和方法

2.1 材料

試驗(yàn)豬選自婁底周邊地區(qū)10個規(guī)?；i場；診斷液和對照液（陽性和陰性血清）、豬藍(lán)耳病正向間接血凝標(biāo)準(zhǔn)致敏紅細(xì)胞稀釋液,均購自深圳某生物科技有限公司；藍(lán)耳病弱毒苗和滅活苗購自廣東某生物制藥有限公司。

2.2 藍(lán)耳病免疫方法

藍(lán)耳病免疫方法見表1。各豬場使用的①號苗為弱毒苗，②號苗為滅活苗，免疫程序?yàn)椋悍N公豬、種母豬每年注射三次；后備母豬配種前6周注射一次，配種前4周再注射一次；仔豬斷奶前一周注射一次，四周后再注射一次；以上注射用量均為每次一頭份（2 mL）。而9、10號豬場為豬藍(lán)耳病陰性豬場，未進(jìn)行豬藍(lán)耳病疫苗注射。

?

2.3 抗體檢測

2.3.1 間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)

（1）采樣：對豬采取耳靜脈采血，每頭豬采血6 mL用于間接凝集試驗(yàn)和ELI SA診斷，編號后并于陰涼處靜置使其血清析出，公豬采樣率為100%，后備母豬采樣數(shù)量占存欄數(shù)量20%，在產(chǎn)母豬采樣數(shù)占存欄數(shù)量15%以上。商品豬采集樣本數(shù)量應(yīng)占存欄數(shù)量的5%以上。

（2）材料：診斷液和對照液（陽性和陰性血清）；豬藍(lán)耳病正向間接血凝標(biāo)準(zhǔn)致敏紅細(xì)胞稀釋液；待檢血清。

（3）操作方法：將待檢血清放入65℃水浴中滅活半小時，先于V型血凝板上每孔中加入20 μL稀釋液，然后再取20 μL待檢血清加入第一孔，充分混合，取出20 μL放人第二孔混勻,依次到第九孔,取出20 μL棄掉。血清稀釋度從第一至第九孔分 別 為 1：2,1：4,1：8,1：16,1：32,1：64,1：128,1：256,1：512，第10孔為陽性血清對照、第11孔為陰性血清對照，第12孔為抗原對照。每孔加入20 μL致敏紅細(xì)胞,振蕩1～2分鐘,置37℃溫箱2小時，判定檢測結(jié)果。

（4）結(jié)果如表 2。

（5）判斷標(biāo)準(zhǔn)

以出現(xiàn)50%凝集的血清最高稀釋度為該血清的間接血凝價，抗體效價在1∶16陽性血清對照組抗體效價為1：512，陰性血清不發(fā)生凝集，即可判為抗體陽性，抗體效價達(dá)到1∶256為抗體水平高，可以抵抗野毒的侵襲。

2.3.2 ELISA診斷

（1）材料準(zhǔn)備：耳病抗體ELISA檢測試劑盒,編號RS 040117 A，購自深圳某生物科技有限公司。血清取自間接血凝試驗(yàn)所采樣的血清。

（2）操作方法：按ELISA檢測試劑盒說明書上操作方法進(jìn)行。

（3）結(jié)果判斷。

?

儀器判斷：以空白對照調(diào)零用酶標(biāo)儀于450 n m（620 n m作參比波長）讀取O D值，待檢孔O D值大于陰性對2.1倍者為陽性。當(dāng)陰性對照O.D值低于0.07時按0.07計算。

S/P值的計算。S/P＝（待檢樣品的平均值-陰性對照的平均值）/（陽性對照的平均值-陰性對照的平均值）。S/P<0.150為陰性,S/P在0.150到0.199為可疑,S/P≥0.2為陽性。

（4）結(jié)果如表3。

?

3 結(jié)果分析與討論

3.1 試驗(yàn)按操作規(guī)程嚴(yán)格操作

間接血凝試驗(yàn)與ELISA試驗(yàn)符合率達(dá)99.69%，表現(xiàn)了高度的符合性，敏感性略低于ELISA，但操作方法簡單，檢測成本低，適用于基層技術(shù)條件低、操作技術(shù)水平較差的人員操作，可用于大規(guī)模的血清流行病學(xué)的調(diào)查和抗體水平的監(jiān)測；而ELISA試劑盒具有靈敏性高，特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性良好的特點(diǎn)，能使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確，可以真實(shí)的反映出豬藍(lán)耳病抗體水平的高低。但操作中加樣量小，手工操作要求精準(zhǔn)，工作溫度及洗板都可能對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響，因此技術(shù)要求高，必須嚴(yán)格按操作規(guī)程進(jìn)行操作。

3.2 免疫合格率低的原因

注射了疫苗的養(yǎng)殖場的陽性率都比較高，但即抗體效價在1∶256及以上的較少，因而其免疫合格率低，此種現(xiàn)象可導(dǎo)致大部分豬只缺乏抵抗野毒的侵襲。究其原因，可能與下列因素有關(guān)：

（1）免疫壓力過重。在所調(diào)查的十個養(yǎng)殖場中，口蹄疫、豬瘟、豬細(xì)小病毒病、豬傳染性腹瀉等疾病時有發(fā)生。為慎重起見，往往給豬接種多種疫苗，而且多種疫苗接種的間隔時間過短，疫苗之間產(chǎn)生干擾作用，不僅使免疫應(yīng)激加重，而且使免疫壓力過重，從而導(dǎo)致免疫失敗。

（2）環(huán)境污染嚴(yán)重。養(yǎng)殖場普遍存在飼養(yǎng)密度高的問題，特別在冬季，由于門窗緊閉，通風(fēng)不良，糞便打掃不干凈或未能及時清掃，致使氨氣及硫化氫等有害氣體濃度升高，導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)受到不良刺激，使豬群健康狀況下降，種母豬多關(guān)于定位欄中進(jìn)行飼養(yǎng)，缺乏活動，身體抵抗力差，應(yīng)激頻繁，使機(jī)體的免疫應(yīng)答能力降低，其抗體始終處于較弱水平，造成免疫失敗。因此要控制藍(lán)耳病，不能完全依賴疫苗，而應(yīng)采取綜合措施。

（3）防疫程序不合理。一直以來，對豬藍(lán)耳病的免疫程序都較混亂，經(jīng)藍(lán)耳疫苗免疫后的母豬所產(chǎn)仔豬在出生后體內(nèi)往往存在母源抗體，如在母源抗體濃度高的時候就注射藍(lán)耳病疫苗，不僅不會產(chǎn)生免疫效果，反而會引起抗體水平下降，因此，對仔豬的免疫注射時間的選擇要建立在抗體水平監(jiān)測的基礎(chǔ)上進(jìn)行，但養(yǎng)殖場往往均是憑經(jīng)驗(yàn)選擇時間，這樣就會導(dǎo)致抗體效價不高，疫苗失去保護(hù)作用。免疫時應(yīng)根據(jù)各豬場的具體情況進(jìn)行適時免疫。合理的免疫程序是弱毒苗和滅活疫苗相結(jié)合的方式。用產(chǎn)生抗體較快的弱毒苗作為基礎(chǔ)免疫，用滅活疫苗進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

（4）未按操作規(guī)程進(jìn)行注射疫苗。養(yǎng)殖場在進(jìn)行疫苗免疫時操作不規(guī)范，消毒措施不嚴(yán)格也是造成免疫效果不好的原因之一。大部分的養(yǎng)殖場雖然有專門的技術(shù)人員負(fù)責(zé)疫苗注射。但實(shí)際操作起來往往是由飼養(yǎng)人員進(jìn)行注射，在注射時針頭沒有做到一豬一針，注射部位不準(zhǔn)確，注射深度不夠，注射用量得不到保證，注射時針頭和注射部位未進(jìn)行消毒或消毒不嚴(yán)格，有的甚至采取打“飛針”進(jìn)行注射，也會造成免疫效果不佳。

3.3 加強(qiáng)豬場藍(lán)耳病監(jiān)測

本次采樣的9號和10號豬場分別是建場一年和三年的新豬場，未曾發(fā)生過豬藍(lán)耳病，因些未進(jìn)行藍(lán)耳病疫苗的注射。但從抗體檢測結(jié)果來看，雖然絕大多數(shù)為陰性，也有小部分為陽性，但抗體效價低，不足以抵抗強(qiáng)毒的侵襲。因此要加強(qiáng)對本病的監(jiān)測，如有本病發(fā)生的可能，要及時進(jìn)行免疫接種，采取相應(yīng)措施，預(yù)防本病的發(fā)生，避免造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失。 □