ZPI基因外顯子-3多態(tài)性與妊娠高血壓疾病子癇前期凝血功能的相關性分析

馬雅英，黃斌倫，王 敏，徐秋仙，程 屹，何云芹

(1.平湖市第一人民醫(yī)院，浙江 平湖 314200；2.金華職業(yè)技術學院醫(yī)學院， 浙江 金華 321017；3.金華市中心醫(yī)院， 浙江 金華 321000)

·基礎與臨床研究·

ZPI基因外顯子-3多態(tài)性與妊娠高血壓疾病子癇前期凝血功能的相關性分析

馬雅英1，黃斌倫2@，王 敏2，徐秋仙3，程 屹3，何云芹3

(1.平湖市第一人民醫(yī)院，浙江 平湖 314200；2.金華職業(yè)技術學院醫(yī)學院， 浙江 金華 321017；3.金華市中心醫(yī)院， 浙江 金華 321000)

目的：探討蛋白Z依賴的蛋白酶抑制劑(ZPI)基因外顯子-3(exon-3)多態(tài)性是否影響妊娠高血壓疾病子癇前期患者的凝血功能。方法選擇無血緣關系的健康孕婦40例、妊娠期高血壓疾病子癇前期患者48例，用凝固法測定凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)和纖維蛋白原含量(Fg)。用直接DNA測序法對ZPI基因exon-3測序分析。結果ZPI 基因外顯子-3在exon-3 137A>G(K46R)、181A>G(S61G)、481A>T(T161S)存在基因多態(tài)性；健康孕婦與妊娠高血壓子癇前期比較，無論哪種基因突變，其不同基因型之間PT、APTT、TT和Fg結果差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。exon-3的181位基因多態(tài)性和exon-3的481位基因多態(tài)性密切相關，即181位基因型為AA型的個體在481位基因上均為AA型，181位基因型為AG型的個體在481位基因上均為AT型，181位基因型為GG型的個體在481位基因上均為TT型。結論ZPI基因exon-3 137A>G、181A>G、481A>T多態(tài)性并不影響妊娠期高血壓疾病子癇前期患者凝血功能，且181A>G基因多態(tài)性變化與481A>T基因多態(tài)性有相關性。

蛋白Z依賴的蛋白酶抑制劑；基因多態(tài)性；子癇前期，妊娠高血壓疾病；凝血功能

Abstract：[Objective]To explore the relationship of the exon-3 polymorphism of protein Z-dependent protease inhibitor (ZPI) gene and the coagulation function of the preeclampsia of hypertensive disorders in pregnancy. [Method] The blood samples were collected from 40 unrelated healthy pregnant women and 48 with the preeclampsia of hypertensive disorders in pregnancy. The prothrombin time (PT), international normalization ratio (INR), activated partial thromboplastin time (APTT) , thrombin time (TT)and fibrinogen (Fg) were measured with solidified method. The exon-3 DNA sequence of ZPI was detected by direct DNA sequencing. [Result] ZPI exon-3 contains three mutations 137A>G(K46R)、181A>G(S61G)and 481A>T(T161S). However, when comparing healthy pregnant women with the preeclampsia of hypertensive disorders in pregnancy, we found that there were no statistical significance between any of them in PT, APTT, TT, and Fg (P>0.05). 181 gene polymorphism in Exon 3 and 481 gene polymorphism in Exon 3 are closely related, with 181 genotype AA, AG and GG being respectively AA,AT and TT in the 481. [Conclusion] ZPI gene polymorphisms of exon-3 137A>G、181A>G、481A>T do not affect the blood coagulation function of the preeclampsia of hypertensive disorders in pregnancy. The genotype of the 181 gene polymorphism in Exon 3 and 481 gene polymorphism in Exon 3 are closely related.

Keywords: protein Z-dependent protease inhibitor；gene ploymorphisms；preeclampsia of hypertensive disorders in pregnancy ；blood coagulation function

蛋白Z依賴的蛋白酶抑制劑(Protein Z-dependent Protease Inhibitor，ZPI)是一種體內重要的抗凝調節(jié)蛋白，在Ca2+、磷脂存在的條件下，與蛋白Z(Protein Z，PZ)、凝血因子Ⅹa結合，形成Ca2+-ZPI-PZ-Ⅹa復合物，抑制Ⅹa活性；另外，ZPI還能直接抑制Ⅺa活性，從多個方面起到抗凝作用，降低機體血栓形成風險。作者在研究ZPI對妊娠期高血壓疾病高凝狀態(tài)是否有影響時，發(fā)現ZPI基因外顯子-3(exon-3)存在基因多態(tài)性。因此，通過對妊娠期高血壓疾病子癇前期患者和健康妊娠婦女ZPI基因exon-3測序對照分析，探討ZPI基因多態(tài)性是否影響妊娠高血壓疾病子癇前期患者的凝血功能。

1 材料和方法

1.1 對象

根據妊娠高血壓疾病診斷和分類標準[1]，收集2010年1月至2011年12月妊娠期高血壓疾病子癇前期患者48例(下稱子癇前期組)，其中輕度子癇前期11例，年齡20～35歲(平均25.5±6.7歲)，孕期37～39周(平均37.5±0.5周)；重度子癇前期37例，年齡22～36歲(平均27.9±3.5歲)，孕期30～39周(平均34.6±2.6周)；同時，收集健康孕婦40例(下稱對照組)，年齡20～38歲(平均27.3±5.8歲)，孕期22～40周(平均29.3±10.2周)。所有研究對象均來自浙江地區(qū)漢族人群無血緣關系。各組均無肝臟疾病、高血壓、糖尿病、血栓病史、腫瘤等病史，也未使用影響凝血功能的藥物。所有受試對象知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標本采集和處理 空腹抽靜脈血，用0.109mol/L枸櫞酸鈉按1:9抗凝，制備泛血小板血漿和全血細胞，部分血漿在2小時內用凝固法測定凝血酶原時間(PT)、國際標準化比值(INR)、活化部分凝血活酶時間(APTT)和凝血酶時間(TT)，具體參見文獻[2]，另一部分血漿和血細胞保存于-80℃超低溫冰箱中，血細胞用于基因測序。

1.2.2 ZPI exon-3測序 用Primer5軟件設計ZPI外顯子-3的引物，上游引物序列為：5'GGGCAGGGCTAACCTACTT3'，下游引物序列為: 5'GCGTCTGGCACTGTTCAATA3'。DNA提取采用生工SK8224試劑盒。用PCR反應擴增儀(加拿大 BBI公司)對ZPI外顯子-3的進行擴增；PCR反應條件：95℃預變性3分鐘，94℃變性30秒，58℃退火35秒，72℃延伸50秒，共35個循環(huán)；最后72℃延伸5分鐘。擴增產物在電壓150V、電流10mA下，1%瓊脂糖凝膠電泳20分鐘。PCR產物用純化回收試劑盒(生工SK1141)回收并純化。用3730XL測序儀(美國 ABI 公司)進行測序。有關基因測序工作由生工生物工程(上海)股份有限公司協(xié)助完成。

2 結果

2.1 ZPI 基因測序結果

通過對對照組和子癇前期組ZPI exon-3測序分析，結果發(fā)現在exon-3 137A>G(密碼子AAG→AGG，賴氨酸→精氨酸即K46R)、181A>G(密碼子AGT→GGA，絲氨酸→甘氨酸即S61G)、481A>T(密碼子ACT→TCT，蘇氨酸→絲氨酸即T161S)存在基因多態(tài)性。

2.2 不同ZPI exon-3多態(tài)性基因的凝血指標測定結果

2.2.1 ZPI exon-3 137A>G基因多態(tài)性凝血指標測定結果 PT(s)、APTT(s)、TT(s)、Fg(g/L) 4項凝血指標，在AA型基因組中，對照組(N=6)和子癇前期組(N=12)分別為11.63±1.12、32.30±3.99、16.20±0.79、2.96±0.44和11.58±1.23、30.85±2.22、16.48±1.16、3.160±0.32；GG型基因組中，對照組(N=18)和子癇前期組(N=16)分別為11.11±1.25、30.49±2.86、15.76±0.93、3.06±0.43和11.60±1.07、31.97±2.25、15.31±0.85、3.10±0.40；AG型基因組中，對照組(N=16)和子癇前期組(N=20)分別為11.50±1.10、30.90±2.12、15.66±1.14、3.15±0.67和11.46±0.81、31.02±1.72、16.14±0.74、3.27.±0.27。經統(tǒng)計學分析，對照組與子癇前期組在不同基因型之間，4種凝血指標差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

2.2.2 ZPI exon-3 181A>G基因多態(tài)性凝血指標測定結果 PT(s)、APTT(s)、TT(s)、Fg(g/L) 四項凝血指標，在AA型基因組，對照組(N=6)和子癇前期組(N=14)分別為11.63±1.12、32.30±3.99、16.20±0.79、2.96±0.44和11.57±1.13、32.23±2.26、16.31±1.15、3.27±0.43；GG型組中，對照組(N=14)和子癇前期組(N=12)分別為11.34±1.33、30.11±3.13、16.00±0.85、2.89±0.25和11.47±0.79、31.80±2.56、15.57±0.83、2.93±0.26；在AG型組中，對照組(N=20)和子癇前期組(N=22)分別為11.26±1.10、31.09±1.97、15.51±1.09、3.25±0.65和11.56±1.04、31.06±1.64、15.93±0.94、3.24±0.42。經統(tǒng)計學分析，對照組與子癇前期組在不同基因型之間，4種凝血指標差異也均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

2.2.3 ZPI exon-3 481A>T基因多態(tài)性凝血指標測定結果 PT(s)、APTT(s)、TT(s)、Fg(g/L) 4項凝血指標，在AA型基因組中，對照組(N=6)和子癇前期組(N=14)分別為11.63±1.12、32.30±3.99、16.20±0.79、2.96±0.44和11.57±1.13、32.23±2.26、16.31±1.15、3.27±0.43；TT型基因組中，對照組(N=14)和子癇前期組(N=12)分別為11.34±1.33、30.11±3.13、16.00±0.85、2.89±0.25和11.47±0.79、31.80±2.56、15.57±0.83、2.93±0.26；AT型基因組中，對照組(N=20)和子癇前期組(N=22)分別為11.26±1.10、31.09±1.97、15.51±1.09、3.25±0.65和11.56±1.04、31.06±1.64、15.93±0.94、3.24±0.42。經統(tǒng)計學分析，對照組與子癇前期組在不同基因型之間，4種凝血指標差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

2.2.4 對照組內和子癇前期組內，對ZPI exon-3 137位各基因型之間凝血指標分別進行比較。對照組內PT(s)、APTT(s)、TT(s)、Fg(g/L) 4項凝血指標，AA型(N=6)分別為11.6±1.1、32.3±3.4、16.2±0.8、2.96±0.44，AG型(N=16)分別為11.5±1.1、30.9±2.1、15.7±1.1、3.15±0.67，GG型(N=18)分別為11.1±1.3、30.5±2.9、15.8±0.9、3.06±0.43，經統(tǒng)計學分析，對照組組內不同基因型之間，各種凝血指標差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。子癇前期組內PT(s)、APTT(s)、TT(s)、Fg(g/L) 4項凝血指標，AA型(N=12)分別為11.6±1.2、30.85±2.2、16.5±1.2、3.16±0.32，AG型(N=20)分別為11.5±0.8、31.02±1.7、16.1±0.7、3.24±0.46，GG型(N=16)分別為11.6±1.1、31.98±2.25、15.3±0.85、3.10±0.40，經統(tǒng)計學分析，子癇前期組組內不同基因型之間，各種凝血指標差異也均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

2.3 3種ZPI基因多態(tài)性之間的相關性分析

以ZPI exon-3 181位基因多態(tài)性作為對照組，觀察與其它2種基因多態(tài)性的相關性，結果見表1。發(fā)現exon-3的181位基因多態(tài)性和exon-3 的481位基因多態(tài)性密切相關，即181位基因型為AA型的個體在481位基因上均為AA型，181位基因型為AG型在481位基因上均為AT型，181位基因型為GG型的在481位基因上均為TT型；另外，與exon-3 的137位基因也密切相關(采用Pearson列聯系數來表示，C=0.777，P<0.001)。

表1 3種ZPI基因exon-3多態(tài)性相關性分析

2.4 ZPI基因外顯子-3多態(tài)性對照組和子癇前期組之間的表達情況

ZPI基因外顯子-3多態(tài)性的3個位點不同基因型在對照組和子癇前期組之間表達情況進行比較，結果見表2。經Pearson卡方檢驗，結果表明2組之間各種基因型表達差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

表2 對照組和子癇前期組ZPI exon-3中3個位點不同基因型表達的比較

3 討論

PT是外源性凝血系統(tǒng)較為敏感的常用篩選實驗,反映血漿中凝血因子Ⅰ、Ⅴ、Ⅶ 、Ⅹ水平；APTT是內源性凝血系統(tǒng)較為敏感的常用篩選實驗,反映血漿凝血因子Ⅷ 、Ⅸ、Ⅹ 、Ⅺ水平；TT主要反映血液中Fg含量和肝素類等抗凝物質是否增多；Fg是血漿黏滯度高低的主要影響因素，在血小板聚集和血栓形成過程中起著重要作用,其含量增高促進血栓形成。以上指標能較好地反映體內凝血狀態(tài)情況。

ZPI基因多態(tài)性與其抗凝活性是否相關，各家報道不一。Laura K等報道[3]ZPI兩個位點錯義突變F145L和Q384R后，從體外研究表明ZPI抑制FXa活性的能力下降，其中Q384R突變后抑制FXa作用減少68%，F145L突變后抑制FXIa作用減少2%～3%，認為這兩個位點突變降低了ZPI抗凝活性，增加血栓形成的風險。Ndonwi M等報道[4]，ZPI基因多態(tài)性K25R、S40G的蛋白質活性與各自的野生型蛋白質活性相似，并經細胞轉染研究表明，這些多態(tài)性不影響蛋白的表達和分泌，說明這兩個位點的基因多態(tài)性不影響蛋白質的功能。本研究中ZPI基因存在K46R、S61G、T161S的3種突變，從實驗結果看，妊娠高血壓子癇前期組與對照組比較，各種基因型之間的各凝血指標差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，說明其多態(tài)性并不影響子癇前期患者的凝血功能，也說明這3種基因突變沒有明顯影響到ZPI的抗凝活性，因此認為這3種基因錯義突變并不是蛋白質肽鏈中關鍵位置上的氨基酸，故不會引起蛋白質功能改變，但出現了蛋白質多態(tài)性。其次，從表2可知，ZPI基因exon-3這3個位點的多態(tài)性表達在子癇前期孕婦與健康孕婦之間差異并無統(tǒng)計學意義，說明其基因多態(tài)性與是否患子癇前期關系不大。

另外，從3種ZPI 的exon-3基因多態(tài)性之間的相關性分析可知，exon-3的181位基因多態(tài)性與481位基因多態(tài)性密切相關，即181位基因型為AA型的個體在481位基因上均為AA型，181位基因型為AG型的在481位基因上均為AT型，181位基因型為GG型在481位基因上均為TT型，這種基因多態(tài)性同步改變，使蛋白質肽鏈上的氨基酸隨之也發(fā)生相應改變，這種變化是否是一種巧合，還是有一定的內在關聯，是否在維持ZPI蛋白質功能方面會產生積極作用，這些有待于今后進一步研究。

[1]樂杰.婦產科學[M].第7版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.92-98，130.

[2]黃斌倫，張浩，金佩佩，等.凝血、抗凝和纖溶指標在深靜脈血栓形成診斷中的價值[J].中華血液學雜志，2009，30(3)：196-198.

[3]Laura K Young, Nigel P. Birch, Peter J. Browett ,et al. Two missense mutations identified in venous thrombosis patients impair the inhibitory function of the protein Z dependent protease inhibitor[J]. Thromb Haemost,2012, 107: 854-863.

[4]Ndonwi M, Lu L, Tu Y, et al. Functional analysis of protein Z (Arg-255His) and protein Z-dependent protease inhibitor (Lys-25Arg and Ser-40Gly) polymorphisms. Br J Haematol, 2008, 143(2) :298-300.

RelevantstudyofZPIexon3polymorphismsandbloodcoagulationfunctionofthepreeclampsiaofhypertensivedisordersinpregnancy

MAYaying1,HUANGBinlun2@,WANGmin2,XUQiuxian3,CHENYi3,HEYunqin3

(1. The First People's Hospital of Pinghu, Zhejiang 314200,China；2 Jinhua College of Profession & Technology, Zhejiang 321017,China；3.Jinhua Municipal Central Hospital, Zhejiang 321000,China)

馬雅英(1972-)，女，浙江平湖人，本科，主管技師。研究方向：止凝血功能及血栓性疾病

金華市科技局重點資助項目(編號：2009-3-037)

黃斌倫huangbinlun@163.com

R714.24+6

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1672-0024(2013)06-0042-04

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