高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水產(chǎn)品硝基呋喃類代謝物殘留

曾春芳，萬譯文，李小玲，劉 麗

(農(nóng)業(yè)部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(長沙)，中國長沙 410153)

硝基呋喃類代謝物屬于一種人工合成的廣譜抗菌藥物，它主要包括呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃它酮等.硝基呋喃類由于具有殺菌性而被廣泛應用于畜禽和水產(chǎn)等動物傳染病預防與治療［1-3］.該類藥物半衰期短，在動物體內(nèi)代謝速度快，與蛋白結(jié)合的代謝物產(chǎn)生穩(wěn)定的殘留，形成的代謝產(chǎn)物3-氨基-2-噁唑烷酮(AOZ)、3-氨基-5-嗎咻代甲基-2-噁唑烷酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)、1-氨基乙內(nèi)酰脲(AHD)均可使動物發(fā)生癌變和基因突變，人類長期使用可對其健康產(chǎn)生危害［4-6］.歐盟在1995年已全面禁止呋喃類抗菌藥物作為生長劑和殺菌劑用在飼料中，我國也于2002年頒布了禁止使用硝基呋喃類藥物的公告.由于硝基呋喃在動物體內(nèi)代謝速度快，不容易在動物組織中被檢測到，通過14C標記表明［7］，硝基呋喃代謝物在動物體內(nèi)以蛋白結(jié)合物的形式存在，在體內(nèi)能殘留數(shù)周，這些結(jié)合殘留物可通過在適當?shù)乃嵝詶l件下釋放出來，以達到檢測硝基呋喃殘留的目的［8］.

由于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法靈敏度高，前處理方法簡單快速，可同時用于產(chǎn)品的檢測和確證，農(nóng)業(yè)部頒布了相關(guān)的標準采用液質(zhì)法應用于食品當中硝基呋喃類代謝物的殘留檢測［9-10］.該方法操作簡單，成本較低，回收率滿足要求，但是由于水產(chǎn)品成分比較復雜，基質(zhì)中含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，前處理過程中沒有采取進一步的凈化，流動相溶解后會有乳化現(xiàn)象產(chǎn)生，容易產(chǎn)生基質(zhì)效應，而且會對儀器造成污染影響結(jié)果的準確性，導致假陽性的情況出現(xiàn).本文建立了水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，通過在前處理過程中采取固相萃取柱進行凈化，減少樣品帶來的基質(zhì)效應，提高了色譜分析的功效，簡單快速，靈敏度高，而且節(jié)約成本，能夠?qū)崿F(xiàn)藥物殘留的快速檢測，可以滿足水產(chǎn)品質(zhì)檢以及相關(guān)基礎研究的要求.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo TSQ Quantum液相色譜-高分辨串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(配用電噴霧離子ESI源);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士布奇公司);高速冷凍離心機(日本日立公司);超聲波清洗器(昆山超聲波儀器廠);精密電子天平(梅特勒—托利多稱重設備系統(tǒng)有限公司);微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠).

AHD、SEM、AMOZ、AOZ 標準品(德國 R-Biopharm 公司);AHD-13C3、SEM-15N13C、AMOZ-D5、AOZ-D4(德國Witega公司);二甲基苯甲醛(色譜純，美國Fluka公司);二甲亞砜(色譜純，美國Fluka公司);甲醇、乙腈(色譜純，美國Tedia公司);正己烷(色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司);乙酸銨(色譜純，美國Fluka公司);甲酸(色譜純，美國Fluka公司);濃鹽酸(優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司);磷酸氫二鉀(分析純，天津光復科技發(fā)展有限公司);固相萃取HLB柱(3 mL，60 mg，美國Waters公司).

標準儲備液的配置:分別稱取硝基呋喃類標準品各10.0 mg，用甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容配置成100 mg/L的標準儲備液，在－18℃下避光保存.使用時將上述標準儲備液混合，用甲醇稀釋成 0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0 mg/L 不同濃度的標準工作液.

內(nèi)標儲備液及使用液的配置:分別稱取10.0 mg各內(nèi)標標準品，用甲醇溶解并定容，配成100 mg/L的標準儲備液，在－18℃下避光保存.準確吸取各內(nèi)標儲備液，用甲醇逐級稀釋配成0.01 mg/L的混合內(nèi)標使用液，在－18℃下避光保存.

1.2 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱:Thermo Scientific Hypersil GOLD C18(2.1 mm ×100 mm，5 μm);柱溫:30℃，流動相 A 為甲醇;B為2 mmol/L的乙酸銨溶液(含0.1%的甲酸);進樣體積:10 μL;流速:0.25 mL/min，流動相梯度見下表1.

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Elution process of the separation

采用電噴霧離子源(ESI);噴霧電壓:4.1 kV;離子傳輸毛細管溫度:350℃;碰撞氣氬氣壓力:0.1 Pa;鞘氣流量:40 arb;輔助氣流量:30 arb;掃描模式:多反應監(jiān)測(SRM);硝基呋喃類代謝物的母離子、子離子和碰撞能量見表2.

表2 8種藥物的SRM采集參數(shù)和標準曲線Tab.2 SRM parameters and linear equations for 8 drugs

1.3 樣品前處理

稱取2 g樣品至于50 mL離心管中(精確至0.01 g)，加入200 μL 0.01 mg/L的混合內(nèi)標溶液，再加入5 mL 0.2 mol/L鹽酸溶液和0.2 mL 0.5 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液，在漩渦混合儀上充分混合1 min.置于恒溫水浴振蕩器中(37℃)避光振蕩16 h，取出離心管冷至室溫，加入5 mL 1.0 mol/L磷酸氫二鉀溶液，調(diào)節(jié)pH至7.0～7.5，加入8 mL正己烷漩渦混勻后放入離心機離心10 min(6 000 r/min)，分層后取下層水相待過柱，固相萃取柱(HLB，3 mL，60 mg)依次用3 mL甲醇，6 mL水活化，取備用液過柱，采用在大氣壓力下自然過柱.過完樣品后，加入3 mL水淋洗并抽干.用4 mL乙酸乙酯分2次洗脫，洗脫液于40℃氮氣吹干后，加入1.0 mL流動相溶解殘渣，再加入2.0 mL正己烷放入離心機離心5 min(5 000 r/min)，取下層液體過0.22 μm濾膜，濾液供液相色譜-質(zhì)聯(lián)用儀測定.

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的選擇及優(yōu)化

考察了甲醇與2 mmol/L的乙酸銨溶液不同體積比例(5∶95、10∶90、15∶85、20∶80)的混合液作為流動相時對目標物分析的影響，綜合考慮目標物的響應值和出峰的時間、峰形的尖銳性，本文選擇2 mmol/L的乙酸銨溶液:甲醇(V∶V=80∶20)為本實驗的最佳流動相.由于水產(chǎn)品成分比較復雜，基質(zhì)中含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物以及色素等雜質(zhì).本文比較了在調(diào)節(jié)pH后加入8 mL正己烷離心和加入流動相后再加入2 mL正己烷離心2種不同的凈化方式，這2種方式去脂的效果均不錯，溶液也較澄清，但是第二種凈化方式，回收率較低，在60%以下，第一種凈化方式的回收率滿足試驗要求.

2.2 固相萃取實驗

固相萃取是一種色譜分離的前處理方法，主要依靠固相萃取柱來進行凈化，不同的基質(zhì)選擇不同材料的固相萃取柱，填料的類型決定了吸附能力的大小以及回收率的高低，本文比較了4種不同的固相萃取柱(C18500 mg/3 mL，HLB 60 mg/3 mL，MCX 150 mg/6 mL，Alumina-N 60 mg/3 mL)對硝基呋喃類代謝物的凈化效果，其回收率的結(jié)果見圖1，本實驗選用HLB柱作為硝基呋喃類代謝物的固相萃取柱，回收率均滿足要求.

固相萃取過程中的洗脫液一般選擇甲醇、乙腈或者乙酸乙酯，本實驗采用乙酸乙酯作為洗脫液，得到良好的洗脫效果.洗脫方式主要考察了一次4 mL、4 mL分2次以及9 mL分3次的3種洗脫方式，從實驗結(jié)果(表3)來看，當用4 mL乙酸乙酯溶液進行洗脫時，目標物洗脫不完全，還有部分目標物在組合SPE柱上沒有被洗脫下來;當用分2次洗脫時(2×2.0 mL)，目標物被完全洗脫，回收率良好;當用洗脫液分3次洗脫時(3×3.0 mL)，回收率與2次洗脫淋洗時差不多，因此本實驗選擇操作簡單、節(jié)約試劑的2×2.0 mL分2次洗脫的方式.

圖1 不同固相萃取柱的硝基呋喃類代謝物回收率Fig.1 Recoveries of metabolites of nitrofuran on different SPE columns.

表3 洗脫方式對回收率的影響Tab.3 Influence of elute style on recovery

2.3 色譜條件的選擇及優(yōu)化

流動相的pH值會影響目標物在色譜柱中的分離.本實驗考慮采用揮發(fā)性電解質(zhì)乙酸銨來做為流動相，同時加入0.1%甲酸控制流動相pH值，采用合適的梯度洗脫程序，不但很好地實現(xiàn)了各種目標物的分離，并且得到了比較理想的色譜峰，峰形尖銳且對稱性好，增大了分子離子峰的峰強度.在8 min內(nèi)，各種硝基呋喃類代謝物均得到了較好的分離.色譜圖見圖2.

2.4 質(zhì)譜條件的選擇及優(yōu)化

根據(jù)硝基呋喃類代謝物的結(jié)構(gòu)特征，采用ESI正離子電離模式，以流動注射泵連續(xù)進樣對1.0 mg/L的標液進行Q1全掃描，掃描范圍為200～400 m/z之間，得到每種組份的分子離子，分別向其分子離子施以碰撞能量形成子離子，接著進行子離子全掃描，找出豐度最強的碎片離子為定量離子，豐度次強的碎片離子為定性離子.同時優(yōu)化錐孔電壓、碰撞能量、鞘氣與輔助氣流量等質(zhì)譜條件，使母離子和子離子組成的特征離子的豐度和比例達到最佳.得到1.2中最佳質(zhì)譜條件.

2.5 線性范圍和靈敏度

配置0.5、1.0、5.0、20.0、50.0 μg/L 的系列標準工作溶液，采用內(nèi)標法定量，以待測物的質(zhì)量濃度 X(μg/L)為橫坐標，待測物與內(nèi)標物的峰面積比值Y為縱坐標制作標準曲線，得到硝基呋喃類代謝物的回歸方程和相關(guān)系數(shù)(見表2).由表2可知，硝基呋喃類代謝物在0.5～50.0 μg/L在范圍內(nèi)其標準曲線的線性關(guān)系良好，相關(guān)性系數(shù)R2在0.997以上.在方法規(guī)定的取樣質(zhì)量條件下，在陰性樣品中添加2種混合標準溶液(添加水平為0.25 μg/kg)經(jīng)測定信噪比(S/N)均大于3，表明這4種物質(zhì)的檢測下限(LOD)為0.25 μg/kg，在陰性樣品中添加2種混合標準溶液(添加水平為0.5 μg/kg)經(jīng)測定信噪比(S/N)均大于10，表明其定量下限(LOQ)可為 0.5 μg/kg.

2.6 回收率與精密度

向草魚、中華鱉和對蝦陰性樣品中分別添加5、20、100 ng/g 3個水平的添加實驗，每個添加水平進行3次實驗，每次平行測定6次，按1.2節(jié)所述條件進行加標回收率實驗，所得結(jié)果為回收率為68.6% ～106.2%，相對標準偏差為1.2% ～10.3%，符合國內(nèi)外有關(guān)標準和法規(guī)的要求，結(jié)果見表4.

圖2 魚肉中硝基呋喃類代謝物(25.0μg/L)及其內(nèi)標溶液的提取離子流色譜圖Fig.2 Extraction ion chromatograms of metabolites of nitrofuran(25.0μg/L)in fish and their internal solution

表4 4種藥物在空白樣品中的添加回收率和相對標準偏差(n=6)Tab.4 Recoveries and relative standard deviations of four drugs in blank samples

3 小結(jié)

通過對前處理條件、色譜條件以及質(zhì)譜條件的優(yōu)化，建立了水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留的檢測方法.結(jié)果表明，該方法在0.5 ～50.0 μg/L 范圍內(nèi)，硝基呋喃類代謝物檢測下限(LOD)為0.25 μg/kg，其定量下限(LOQ)可為0.5 μg/kg;在3個不同的添加水平下，其回收率為68.6% ～106.2%，相對標準偏差為1.2% ～10.3%.本方法前處理步驟簡單、回收率穩(wěn)定、精密度好，滿足我國以及歐盟等國家的限量要求，可以作為水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的檢測方法，并可為該類藥物在水產(chǎn)品中的消除規(guī)律及毒理評價提供靈敏、準確的分析手段，對水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的溯源和衛(wèi)生監(jiān)督提供了技術(shù)支撐.

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