外周血淋巴細(xì)胞替代肺癌細(xì)胞體外藥敏實(shí)驗(yàn)的相關(guān)性研究

段國辰 杜錦波 牛占叢

化療在非小細(xì)胞肺癌治療中占有重要地位。常用的化療方案來源于多地區(qū)，大樣本的臨床統(tǒng)計(jì)資料。但部分具有相同病理類型患者對同一化療方案卻顯示不一樣的療效。如何選擇化療藥物，實(shí)現(xiàn)肺癌患者的個(gè)體化治療，提高療效，已經(jīng)成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)道:多種器官惡性腫瘤的原代細(xì)胞培養(yǎng)及其藥敏實(shí)驗(yàn)可以作為個(gè)體化化療的理論指導(dǎo)［1，2］。研究證實(shí)，不同個(gè)體之間對藥物的敏感性與其遺傳因素有著很大的關(guān)系。外周靜脈血淋巴細(xì)胞與實(shí)體瘤細(xì)胞同樣具有耐藥基因的表達(dá)［3］。有文獻(xiàn)報(bào)道MTT法檢測自身外周血淋巴細(xì)胞和患者癌細(xì)胞對同一化療藥物的敏感性存在良好的正相關(guān)性［4］。然而其相關(guān)性在肺癌方面的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法測定60例自身外周血淋巴細(xì)胞及其肺癌細(xì)胞對常用的4種化療藥物的敏感性，探討兩者的相關(guān)性旨在用外周血淋巴細(xì)胞替代肺癌細(xì)胞進(jìn)行化療藥敏檢測。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年03月至2011年09月我院收治的60例肺癌手術(shù)標(biāo)本，且術(shù)前均未接受放療及化療治療。其中鱗癌34例，腺癌26例。根據(jù)UICC(1997)的分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰb期10例，Ⅱ期30例，Ⅲa期20例。切除的腫瘤組織，均有病理學(xué)診斷。

1.2 方法 在手術(shù)室無菌條件下，取約黃豆大小的腫瘤組織，經(jīng)大量0.9%氯化鈉溶液充分沖洗后置于含有雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液的標(biāo)本瓶中，立即送檢。所有患者于術(shù)中切除肺癌組織后抽取外周靜脈血2 ml置于EDTA管中。

1.2.1 肺癌細(xì)胞單細(xì)胞懸液制作方法:①取小塊約黃豆大小的新鮮腫瘤組織用500 ml 0.9%氯化鈉溶液充分洗凈去除表面的血細(xì)胞后立即浸入含有雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液的無菌小瓶中，立即送往實(shí)驗(yàn)室。②將取下的腫瘤組織放入培養(yǎng)皿中，用RPMI-1640液沖洗后再用眼科剪去除組織表面的臟層胸膜，及非腫瘤組織。再將腫瘤組織用眼科剪剪成肉末狀。③加入0.5 ml胰酶消化液放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)15 min。④取出消化好的腫瘤組織，加入10 ml含有10%胎牛血清的RPMI-1640液終止消化。⑤將此腫瘤細(xì)胞液經(jīng)200目的鋼網(wǎng)過濾，再反復(fù)吹打，即可得到單細(xì)胞腫瘤液。⑥使用臺盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)，最終調(diào)整細(xì)胞數(shù)為(1～2)×105/ml。

1.2.2 淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液制作方法:①在無菌條件下，將外周靜脈血2 ml加入10 ml的離心管中，再緩慢加入2 ml的人淋巴細(xì)胞分離液，2 000 r/min離心30 min。②分離出位于中層的白色細(xì)胞層即為外周血淋巴細(xì)胞層，用pbs液洗滌2次，棄去上清液。③用含10%胎牛血清的RPMI-1640液配制成單個(gè)細(xì)胞懸液。④使用臺盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)，最終調(diào)整細(xì)胞數(shù)為(1～2)×105/ml。

1.3 分組加藥 (1)加藥組:肺癌細(xì)胞或淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液100μl/孔，化療藥10μl/孔，含10%胎牛血清的RPMI-1640液90μl/孔。(2)陰性對照組:肺癌細(xì)胞或淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液100μl/孔，含10%胎牛血清的 RPMI-1640液100μl/孔。(3)空白對照組:含10%胎牛血清的RPMI-1640液200μl/孔。每組10個(gè)復(fù)孔，加藥后經(jīng)震蕩充分混勻，將96孔板置于37℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)48 h。(4)培養(yǎng)44 h后將 MTT試劑20μl/孔分別加入96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。從37℃、5%CO2恒溫箱中取出96孔板，每孔吸去上清液200μl，再將每孔加入DMSO 100μl，再將96孔板放置于震蕩器震蕩15 min使沉淀充分溶解，用酶標(biāo)儀(波長為490 nm)測每孔的OD值，據(jù)相對抑制率來判斷藥物敏感性。(5)計(jì)算公式如下相對抑制率=(1-加藥孔平均OD值/對照孔平均OD值)×100%。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn) 高度敏感為相對抑制率≥50%;敏感為相對抑制率≥30%;耐藥為相對抑制率＜30%［5］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，兩兩比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用直線相關(guān)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 同一種化療藥物卡鉑、長春新堿、五氟尿嘧啶、環(huán)磷酰胺對患者肺癌細(xì)胞和自身外周血淋巴細(xì)胞的抑制率之間具有良好的正相關(guān)性。相關(guān)系數(shù)分別為:0.701、0.668、0.543、0.696，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 60例肺癌患者腫瘤細(xì)胞及自身外周血淋巴細(xì)胞對4種化療藥物敏感性的相關(guān)性比較n=60，±s

表1 60例肺癌患者腫瘤細(xì)胞及自身外周血淋巴細(xì)胞對4種化療藥物敏感性的相關(guān)性比較n=60，±s

藥物 腫瘤細(xì)胞 淋巴細(xì)胞 相關(guān)系數(shù) P值CBDCA 34.51±7.20 26.48±5.51 0.701 0.000 VCR 29.04±5.41 21.04±4.75 0.668 0.000 5-Fu 31.40±4.84 22.73±3.47 0.543 0.000 CTX 26.05±3.32 16.85±3.27 0.696 0.000

2.2 根據(jù)60例肺癌細(xì)胞和自身外周血淋巴細(xì)胞對化療藥物的敏感率(敏感率=敏感病例數(shù)/病歷總數(shù)×100%)來分析:患者肺癌細(xì)胞和自身外周血淋巴細(xì)胞對相同化療藥物卡鉑、長春新堿、五氟尿嘧啶、環(huán)磷酰胺的敏感率無顯著性差異，χ2值分別為 0.786、1.645、0.263、0.261，且均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表2。

表2 60例肺癌患者腫瘤細(xì)胞及自身淋巴細(xì)胞對4種化療藥物的敏感率比較 n=60，例

3 討論

到21世紀(jì)初，在癌癥死亡原因中，患肺癌的死亡率已由20世紀(jì)70年代的第4位躍居到第一位。肺癌的治療包括手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療和生物治療。其中化療可殺死血液里的腫瘤細(xì)胞作為全身治療已成為腫瘤治療的不可替代的方法。目前在臨床使用的抗癌藥物均有不同程度的毒副作用，這是由于抗癌藥物對腫瘤細(xì)胞的選擇性不佳，導(dǎo)致化療失敗。所以針對個(gè)體化的化學(xué)治療逐漸成為研究的重點(diǎn)。MTT法被廣泛用于腫瘤細(xì)胞的抗癌藥物敏感實(shí)驗(yàn)，為個(gè)體化化學(xué)治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)［6，7］，很大程度上避免耐藥性的發(fā)生，因此也減少了用藥的盲目性，同時(shí)在很大程度上減少了腫瘤的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，提高了五年生存率［8］。

臨床經(jīng)常遇到以下問題:大多數(shù)肺癌患者一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就屬晚期，失去手術(shù)機(jī)會;或由于各種原因無法得到足夠量的肺癌組織標(biāo)本;多次化療的肺癌患者效果差疑似藥物敏感譜發(fā)生改變;如何進(jìn)行個(gè)體化化療。針對上述因標(biāo)本來源問題無法進(jìn)行肺癌細(xì)胞體外藥敏實(shí)驗(yàn)的患者來說，能否利用外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行化療藥物敏感實(shí)驗(yàn)來代替腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性已成為目前研究的熱點(diǎn)。白細(xì)胞數(shù)為患者能接受化學(xué)治療的重要參考指標(biāo)。在臨床工作中肺癌患者接受化療的同時(shí)，自身白細(xì)胞也會有一定程度的降低，這一現(xiàn)象說明化療藥物不僅能殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)也能殺死外周血淋巴細(xì)胞。我們通過基因組計(jì)劃的順利完成得知同一個(gè)體的正常體細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞在基因組上是完全相同的。目前已經(jīng)有大量研究表明，腫瘤細(xì)胞與外周血淋巴細(xì)胞攜帶有大量的同源基因，均具有耐藥基因表達(dá)［9］。本實(shí)驗(yàn)顯示:肺癌患者腫瘤細(xì)胞及其自身外周血淋巴細(xì)胞對同一種化療藥物卡鉑、長春新堿、五氟尿嘧啶、環(huán)磷酰胺的敏感性是基本一致的。由表2可知肺癌細(xì)胞及自身外周血淋巴細(xì)胞對同一化療藥物卡鉑、長春新堿、五氟尿嘧啶、環(huán)磷酰胺的敏感性具有良好的正相關(guān)性。相關(guān)系數(shù)分別為:0.701、0.668、0.543、0.696，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本結(jié)果表明肺癌細(xì)胞和自身外周血淋巴細(xì)胞對相同化療藥物卡鉑、長春新堿、五氟尿嘧啶、環(huán)磷酰胺的敏感率無顯著性差異，χ2值分別為0.786、1.645、0.263、0.261，且均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞ 0.05)。由此結(jié)果提示:肺癌患者外周血淋巴細(xì)胞替代腫瘤細(xì)胞進(jìn)行體外藥敏實(shí)驗(yàn)是可行的。所以當(dāng)患者已經(jīng)失去手術(shù)機(jī)會，無法獲得肺癌組織標(biāo)本及病理類型或者隨著化療次數(shù)的增加，腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性可能會有所改變，因無法取得腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行藥敏檢測，此時(shí)應(yīng)用外周血淋巴細(xì)胞來替代肺癌細(xì)胞進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)則更具有臨床意義。

肺癌原代細(xì)胞培養(yǎng)的藥敏試驗(yàn)為肺癌患者篩選合適的化療藥物具有重要的意義，同時(shí)很大程度上避免了用藥的盲目性。為肺癌的個(gè)體化化學(xué)治療提供了思路。同時(shí)可以減輕不必要的藥物浪費(fèi)，提高療效。淋巴細(xì)胞代替肺癌細(xì)胞進(jìn)行藥敏試驗(yàn)來選擇化療藥物是可行的。這樣便可以解決以下問題:(1)患者已經(jīng)失去手術(shù)機(jī)會，無法獲得肺癌組織標(biāo)本及病理類型。(2)腫瘤細(xì)胞難以純化、非腫瘤成分多容易干擾藥敏結(jié)果。(3)腫瘤組織污染較重，明顯影響藥敏結(jié)果。(4)多次化療的肺癌患者效果差疑似耐藥。

本研究以MTT法為手段檢測了60例自身外周血淋巴細(xì)胞及肺癌細(xì)胞體外的藥物敏感性。結(jié)果顯示:同一化療藥物對同一例肺癌患者的外周血淋巴細(xì)胞和肺癌細(xì)胞的抑制率具有良好的正相關(guān)性。另外，體內(nèi)和體外對藥物的代謝動力學(xué)存在差異，應(yīng)進(jìn)行長期的體外藥敏實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)臨床患者的化學(xué)治療，進(jìn)一步驗(yàn)證體外藥敏實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)臨床化療的可行性，為肺癌患者的個(gè)體化治療提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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