軟脂酸抑制C2C12肌細胞PGC-1α的表達

牛尚梅 馬慧娟 劉晶 高哲 李彩英 馬博清

游離脂肪酸(FFA)水平升高在肥胖、胰島素抵抗和2型糖尿病中發(fā)揮重要作用［1］。不同類型脂肪酸與胰島素敏感性關系不盡相同，其中長鏈飽和與不飽和脂肪酸與胰島素抵抗(IR)關系密切。實驗表明給予大鼠高飽和脂肪酸飲食可以導致大鼠IR［2］，具體機制尚不十分清楚，可能與骨骼肌過氧化物酶體增生物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptorγ coactivator 1α，PGC-1α)的轉錄調控有關。PGC-1α是一種核轉錄共激活因子，其在線粒體功能和IR中的作用成為近年來研究的熱點。動物研究發(fā)現(xiàn)Zucker糖尿病肥胖大鼠骨骼肌PGC-1α表達下調［3］。高脂與PGC-1α表達，IR關系密切。本研究擬采用不同類型長鏈脂肪酸培養(yǎng)C2C12肌細胞，探討脂肪酸類型及濃度對骨骼肌PGC-1α表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 實驗用脂肪酸購自Sigma公司，C2C12細胞株購自北京協(xié)和細胞庫。目的引物由上海生物工程公司合成，β-actin 上游引物:5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’，下游引物:5’-TCC ACCACCCTGTTGCTGTA-3’;PGC-1α 上游引物5’-TCAGTCCTCACTGGTGGACA-3’，下游引物 3’-TGCTTCGTCGTCAAAAACAG-3’。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與傳代:C2C12肌細胞貼壁生長于含20%小牛血清、0.6/L谷氨酞胺，6.672/LHEPES，100 U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI1640中，于37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)。以1X106/培養(yǎng)瓶傳代細胞，3天后分別予 0 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、0.75 mmol/L 軟脂酸、硬脂酸、棕櫚酸、油酸和亞油酸處理細胞，持續(xù)24 h孵育。

1.2.2 試驗分組:對照組(Con)，軟脂酸組(C16∶0)、硬脂酸組(C18∶0)、棕櫚酸(C16∶1)組、油酸組(C18∶1)以及亞油酸組(C18∶2)，均分別采用0.25、0.5和0.75 mmol/L三個濃度孵育C2C12細胞。

1.2.3 熒光定量PCR分析:取RNA溶液4μl，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，明顯可見28S、18S條帶，且28S為18S條帶的兩倍，5S條帶較弱，且彌散，表明RNA降解較少，完整性良好。用756型紫外分光光度計分別測定 OD260與 OD280，選用OD260/OD280比值為1.8～2.0的RNA用作反轉錄。PCR熱循環(huán)參數(shù):96℃ 4min，然后三步反應:94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃30 s，進行40個循環(huán)，于每個循環(huán)的第三步72℃ 30 s收集熒光信號。擴增完畢后，進入結果分析界面，以β-actin為內(nèi)參照基因，與對照組相比，得到目的基因表達的相對定量值(RQ值)，將RQ值用于統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學分析應用SPSS13.0軟件統(tǒng)計，計量資料以±s表示，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度脂肪酸對肌細胞PGC-1αmRNA表達的影響在脂肪酸濃度為0.25 mmol/L時，軟脂酸組(C16∶0)、硬脂酸組(C18∶0)、棕櫚酸組(C16∶1)、油酸組(C18∶1)以及亞油酸組(C18∶2)的PGC-1αmRNA表達與對照組比較均無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。見表1。

在脂肪酸濃度為0.5 mmol/L和0.75 mmol/L時，軟脂酸組PGC-1αmRNA表達較對照組降低(P＜0.05);棕櫚酸組、油酸組、亞油酸組PGC-1αmRNA表達與對照組和軟脂酸組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 軟脂酸孵育時間對PGC-1αmRNA表達的影響 軟脂酸培養(yǎng)的肌細胞，在1 h，PGC-1αmRNA表達較0 h差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，在培養(yǎng)6 h、12 h、24 h PGC-1α mRNA 表達較0 h。1 h降低，而24 h降低最明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。見表2。

表1 不同濃度脂肪酸孵育后PGC-1αmRNA表達變化比較

表1 不同時間脂肪酸孵育后PGC-1αmRNA表達變化比較

3 討論

FFA水平升高可能導致肌內(nèi)脂質堆積，從而產(chǎn)生IR，具體機制尚不十分清楚，可能與骨骼肌PGC-1α的轉錄調控有關。血中FFA是由不同長度和飽和度的脂肪酸組成，根據(jù)碳鏈的不同分為短鏈(2～4)、中鏈(6～8)和長鏈(10～24)，根據(jù)有無雙鍵分為飽和與不飽和脂肪酸。不同類型脂肪酸與胰島素敏感性關系不盡相同，其中長鏈飽和與不飽和脂肪酸與胰島素抵抗關系密切。胰島素抵抗者骨骼肌甘油三酯以飽和脂肪酸增加為主，并且與胰島素抵抗有直接關系［4］。骨骼肌PGC-1α表達下降使線粒體氧化葡萄糖和脂肪酸能力降低，過多脂質在相應組織骨骼肌堆積，導致胰島素抵抗［5］。研究發(fā)現(xiàn)給正常人輸入脂肪酸混合劑24小時降低了肌肉PGC-α和氧化磷酸化基因的表達［6］，通過慢性運動可以改變PGC-1α的表達，改善胰島素敏感性［7］。體外實驗證實軟脂酸可以誘導骨骼肌細胞 IR，而油酸可以逆轉這一作用［8］，軟脂酸亦可以誘導3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗，其機制可能與激活JNK通路有關［9］。本研究發(fā)現(xiàn)飽和脂肪酸，軟脂酸孵育的C2C12肌細胞PGC-1α的表達下降，這與Crunkhorn等［10］的研究結果一致。而不飽和脂肪酸，棕櫚酸組、油酸組、亞油酸組培養(yǎng)的肌細胞PGC-1α的表達較對照組無明顯變化。說明脂肪酸誘導的PGC-1α的下降依賴于他們的結構或特殊的氧化產(chǎn)物。

Coll等［11］研究了不同時間軟脂酸對骨骼肌細胞PGC-1α表達的作用，發(fā)現(xiàn)1 h無變化，4 h(2倍，有意義)和8 h(1.5倍，有意義)輕度變化，較大下降在16 h后，16 h后表達下降55%。本研究顯示軟脂酸對PGC-1α的抑制作用出現(xiàn)在6 h，24 h抑制作用最強，與上述結果類似，說明飽和脂肪酸對PGC-1α的抑制作用有時間依賴性，可能與底物的作用或氧化增加有關。本研究采用250、500、700μmol/L三個濃度，在低濃度(250μmol/L)PGC-α表達無明顯變化，但在500μmol/L即出現(xiàn)PGC-1α表達下降，700μmol/L濃度時更明顯。已知在肥胖和2型糖尿病者血漿 FFA升高，一般都超過 500μmol/L，而本研究在500μmol/L已經(jīng)出現(xiàn) PGC-1α表達下降，分析可能是血漿中FFA是不同類型脂肪酸的總合，包括長鏈、短鏈、飽和以及不飽和。所以單純一種脂肪酸來說500μmol/L的濃度已經(jīng)是比較高的劑量，從而影響了PGC-α的表達，而且這種影響與脂肪酸濃度有關。

軟脂酸誘導的PGC-1α表達下降可同時伴有許多三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化基因的下降，基因敲出小鼠PGC-1α表達下降使線粒體基因表達和骨骼肌數(shù)量降低［13］。所以軟脂酸誘導的PGC-1表達下降，可能導致線粒體功能異常，并且這種異常與胰島素抵抗有關，但具體的作用機制仍然不清楚，需要進一步的研究。

1 Boden G，Shulman GI.Free fatty acids in obesity and type 2 diabetes:defining their role in the development of insulin resistance and beta-cell dysfunction.Eur JClin Invest，2002，32(Suppl3):14-23.

2 宋光耀，高宇，周宇，等.高飽和脂肪酸、高不飽和脂肪酸、高糖不同飲食誘導高血壓伴胰島素抵抗大鼠的研究.中國病理生理雜志，2006，22:2270-2273.

3 Sriwijitkamol A，Ivy JL，Christ-Roberts C，et al.LKB1-AMPK signaling in muscle from obese insulin-resistant Zucker rats and effects of training.Am JPhysiol Endocrinol Metab，2006，290:E925-932.

4 Manco M，Mingrone G，Greco AV，et al.Insulin resistance directly correlates with increased saturated fatty acids in skeletal muscle triglycerides.Metabolism，2000，49:220-224.

5 Barroso E，Rodríguez-Calvo R，Serrano-Marco L，et al.The PPARβ/δ activator GW501516 prevents the down-regulation of AMPK caused by a high-fat diet in liver and amplifies the PGC-1α-Lipin 1-PPARα pathway leading to increased fatty acid oxidation.Endocrinology，2011，152:1848-1859.

6 Richardson DK，Kashyap S，Bajaj M，et al.Lipid infusion decreases the expression of nuclear encoded mitochondrial genes and increases the expression of extracellular matrix genes in human skeletal muscle.J Biol Chem，2005，280:10290-10297.

7 Li L，Pan R，Li R，et al.Mitochondrial biogenesis and peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α (PGC-1α)deacetylation by physical activity:intact adipocytokine signaling is required.Diabetes，2011，60:157-167.

8 Coll T，Eyre E，Rodriguez-Calvo R，et al.Oleate reverses palmitate-induced insulin resistance and inflammation in skeletal muscle cells.JBiol Chem，2008，283:11107-11116.

9 Davis JE，Gabler NK，Walker-Daniels J，et al.The c-jun N-terminal kinase mediates the induction of oxidative stress and insulin resistance by palmitate and toll-like receptor 2 and 4 ligands in 3T3-L1 adipocytes.Horm Metab Res，2009，41:523-530.

10 Crunkhorn S，Dearie F，Mantzoros C，et al.PGC-1 expression is reduced in obesity:potential pathogenic role of saturated fatty acids and p38 MAPkinase activation.JBiol Chem，2007，282:15439-15450.

11 Coll T，Jove M，Rodriguez-Calvo R，et al.Palmitate-Mediated Downregulation of Peroxisome Proliferator–Activated ReceptorγCoactivator 1α in Skeletal Muscle Cells Involves MEK1/2 and Nuclear Factor-κB Activation.Diabetes，2006，55:2779-2787.

12 Lin J，Wu PH，Tarr PT，et al.Defects in adaptive energy metabolism with CNS-linked hyperactivity in PGC-1alpha null mice.Cell，2004，119:5-7.