沉淀法分離硫酸粘桿菌素工藝研究

丁緒芹，張勁松，王福嶺

(1．明治醫(yī)藥(山東)有限公司，山東濟寧 272100;2．山東勝利生物工程有限公司，山東濟寧 272100)

多粘菌素E是一種堿性多肽類抗生素，獸用硫酸粘菌素商品為其硫酸鹽。目前生產中主要通過樹脂法分離提?。?－2］，但此法帶來大量的污水，嚴重污染環(huán)境。文獻報道關于多粘菌素E分離技術較多，如膜分離法、溶媒萃取法、吸附法［3］、泡沫分離法［4］，但都處于試驗階段，尚未形成成熟工藝，無法應用于工業(yè)化生產。沉淀法分離抗生素是一種傳統(tǒng)方法，操作簡單，但由于多粘菌素在較強酸堿溶液中的不穩(wěn)定性，目前尚無利用此法的生產報道。本文通過對沉淀法分離多粘菌素E進行研究，優(yōu)化各項工藝操作參數，以期得到一種適用于工業(yè)化生產的分離工藝。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器 多粘菌素E標品由上海江萊生物科技有限公司提供，硫酸及硫酸鹽(AR)由濟南市恒德銳化工有限公司生產。

高壓液相色譜(LC－3000，山東金普分析儀器有限公司)，陶瓷膜超濾設備(合肥世杰膜工程有限責任公司)，恒溫水浴鍋(DHKW，北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，真空泵(SHZ－C全不銹鋼，上?；ゼ褍x器設備有限公司)。

1．2 方法

1．2．1 發(fā)酵液預處理 2%硫酸調節(jié)發(fā)酵液pH 4．8左右，酸化0．5 ～1 h 后，陶瓷膜超濾。

1．2．2 多粘菌素E測定 采用高效液相色譜法(HPLC)，參照文獻［5－6］提供方法。

1．2．3 結晶及濃縮液制備方法 取一定體積超濾液，濃堿緩慢均勻攪拌加入，pH調至12．3～12．5，靜置0．5 h后過濾抽干即得濕晶體，濕晶體用1 mol/L酸溶解后，去離子水定容至1/10體積。

1．2．4 計算方法 總億=效價×體積/109;收率(%)=濃縮液總億/超濾液總億×100%;母液殘留率(%)=母液殘留總億/超濾液總億×100%;降解率(%)=100%–(收率+母液殘留率)。

2 結果與分析

2．1 溫度對多粘菌素E穩(wěn)定性及結晶收率影響

在不同的水浴溫度中靜置結晶(圖1)，20℃左右收率達到最高，此時母液殘留率及降解率達到最低點。結果表明:過低溫度不利于多粘菌素結晶，可能與其沉淀是非晶體絮凝物有關，相對較高的溫度有利于絮凝沉淀快速形成，從而減少母液中游離肽的降解量。

圖1 結晶溫度對多粘菌素E沉淀效果的影響

不同溫度條件下，延長母液及濕晶體在堿性條件下的處理時間，分別測定溫度對母液中游離肽和沉淀結晶的影響。

不同溫度條件下母液處理結果如圖2所示，堿性條件下溫度對游離肽的穩(wěn)定性影響較大，6 h時5℃降解率3%左右，15℃降解率升至13%以上，25℃以上時降解率達到40%。結果表明:較高溫度條件下游離肽的穩(wěn)定性差，同時降解率隨處理時間的延長明顯升高。

圖2 堿性條件下溫度對游離肽降解率的影響

溫度對濕晶體穩(wěn)定性的影響如圖3所示，低溫條件下濕晶體的穩(wěn)定性相對較高，同時隨著時間延長，降解率的累積明顯升高，6 h時5℃條件下，降解率接近2%。

圖3 堿性條件下溫度對濕晶體穩(wěn)定性的影響

結果表明:堿性條件下，游離肽的穩(wěn)定性較差，易發(fā)生降解或與低糖及氨基酸產生美拉德反應［7－8］，而沉淀狀態(tài)結晶穩(wěn)定性高。低溫不利于沉淀結晶快速形成，導致降解量升高，而過高的溫度直接加速降解反應速率，也不利于結晶收率。因此，最佳的結晶溫度在20℃左右，既有利于結晶快速大量形成，同時降解率相對偏低，有利于得到最高的結晶收率。

2．2 pH對多粘菌素E穩(wěn)定性及結晶收率影響試驗中發(fā)現，在pH接近9．0時，開始出現大量絮狀沉淀結晶，因此考察了晶體出現前的pH對多粘菌素E最終收率的影響(圖4)。pH調至試驗設定值時靜置0．5 h 后，調至12．3 ～12．5 結晶。

圖4 結晶過程中間pH對結果的影響

結果可見，pH＞8．5時，游離態(tài)多粘菌素的穩(wěn)定性開始快速下降，容易發(fā)生降解反應;同時說明游離肽在堿性條件下的存在時間對收率有重要影響，即較短的結晶時間，沉淀加速析出，降低了游離肽的降解時間及降解量。

結晶pH對結晶效果的影響如圖5所示，結果可見:pH在11．5～12．0之間，結晶收率為88%左右，達到最高。pH過低，母液中殘留效價較高，導致降解率較高;反之pH過高，直接導致降解速率加快，收率降低。結果表明:pH 11．5～12．0時，收率較高，且降解率相對較低。

圖5 結晶pH對多粘菌素E結晶效果的影響

圖6 結晶靜置時間對結晶效果的影響

2．3 結晶時間對多粘菌素E穩(wěn)定性及結晶收率影響 多粘菌素E在堿性條件下穩(wěn)定性較差，結晶時間對其降解量及收率影響可能較大。結晶后靜置時間對結晶效果的影響(圖6):0．5h時母液殘留最高，降解率最低;1 h左右收率達到最高，之后收率下降，母液殘留率基本穩(wěn)定在4% ～4．5%，降解率快速升高。結果表明:結晶后靜置1 h左右有利于完全沉淀，時間過長，則降解率過高，不利于收率提高。

進一步考察結晶過程pH調節(jié)速率對結晶效果的影響(圖7):結果可見，隨著加堿時間延長，收率逐步降低，降解率升高，與上步試驗相印證。結果表明:縮短pH調節(jié)時間快速結晶，有利于結晶快速出現，減少降解時間，提高收率。

圖7 pH調節(jié)速率對結晶效果的影響

2．4 晶種對多粘菌素E穩(wěn)定性及結晶收率影響

pH調至9．5左右時，結晶開始明顯出現，此時加入不同量晶種(圖8)。

圖8 外加晶種量對結晶效果的影響

結果可見，添加1‰量晶種，收率達到90%，加晶種組收率明顯高于對照組，同時降解率及母液殘留率也較低，說明加入晶種增加晶核量，對沉淀結晶的出現及生長有促進作用。

0．5‰晶種加入時pH對結晶效果的影響(圖9):pH 9．5時加入晶種，收率接近90%，明顯高于其他組。pH 9．8時，自然晶核已經大量形成，外加晶核作用減弱，晶核量加入過少，差異性不顯著;pH 9．2時，晶核加入過早對收率影響不大。

圖9 0．5‰晶種加入pH對結晶效果的影響

結果表明:pH 9．5時，外加0．5‰ ～1‰晶種對結晶有明顯促進作用。

2．5 保護劑對多粘菌素E穩(wěn)定性及結晶收率影響

試驗初期發(fā)現還原性保護劑對多粘菌素E在高溫條件下的穩(wěn)定性有一定幫助作用，結晶過程保護劑對結晶效果的影響如圖10所示。

圖10 不同保護劑比例對結晶效果的影響

結果可見，母液中殘留效價隨助劑的加入量增多而提高，降解率升高，導致收率降低。結果表明:保護劑對多粘菌素E可能有一定鹽溶影響，增加其游離態(tài)溶解度，導致不易沉淀，降解率升高，總體上保護劑對收率未發(fā)揮積極作用。

2．6 過濾溫度對多粘菌素E穩(wěn)定性及結晶收率影響 過濾時間在2～3 h，且結晶液和晶體處于堿性條件，試驗中環(huán)境及設備溫度對多粘菌素的穩(wěn)定性都可能造成影響，過濾溫度對母液及晶體的穩(wěn)定性如圖11所示。

結果可見:5℃時收率最高達到96%以上，母液殘留幾乎為0，降解率小于3%，溫度升高各項指標都對收率不利。結果表明:結晶液在過濾前降低溫度至10℃以下，有利于穩(wěn)定性以及收率提高。

圖11 過濾溫度對結晶效果的影響

3 結論

本研究結果表明，最佳結晶條件:pH 11．5～12．0，結晶溫度 15 ～20 ℃，結晶后靜置 0．5 ～1 h，最高收率達到95%以上，脫色后噴霧干燥，成品各項指標達到CP和EP標準。目前尚未解決的問題主要有濃縮液色素量不穩(wěn)定對結晶及脫色過程的影響、脫色及成品質量穩(wěn)定性等，有待進一步研究和探索。

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