豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒的研制及初步應(yīng)用

廖園園，李 建，秦 偉，朱 薇，曹 娟，漆世華，謝紅玲，溫文生

(武漢中博生物股份有限公司，武漢 430070)

豬圓環(huán)病毒(PCV)是迄今發(fā)現(xiàn)最小的動物病毒?，F(xiàn)已知PCV有2個血清型，即PCV1和PCV2。PCV1為非致病性的病毒，PCV2為致病性的病毒，是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原［1］。除了引發(fā)PMWS外，PCV2還與豬皮炎腎炎綜合征(PDNS)、豬增生性壞死性肺炎(PNP)、仔豬先天性震顫(CT)、母豬繁殖障礙等疾病相關(guān)［2］，是全球公認(rèn)的危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疫?。?］。Cap蛋白是該病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，含有4個抗原表位，具有較好的免疫原性和抗原性，是檢測該病毒特異性抗體的理想靶抗原表位［4］。為建立一種敏感、特異、快速的豬圓環(huán)病毒2型抗體檢測方法，使PCV2疫苗的效果評價更快捷、準(zhǔn)確和方便，本研究利用捕獲包被和間接ELISA法研制了一種檢測PCV2抗體的試劑盒，并初步應(yīng)用于豬圓環(huán)病毒2型疫苗免疫效果評價。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 主要試劑和儀器 PCV2病毒由本實驗室保存;PCV2陽性質(zhì)控豬血清及陰性質(zhì)控豬血清、PCV1陽性豬血清、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)陽性豬血清、豬瘟病毒(CSFV)陽性豬血清、豬細(xì)小病毒(PPV)陽性豬血清、豬偽狂犬病病毒(PRV)陽性豬血清由本實驗室制備;178份豬血清樣本采自湖北博牧豬場。

豬圓環(huán)病毒抗體檢測試劑盒(進(jìn)口)，貨號107SD310;豬圓環(huán)病毒2－dCap－ELISA抗體檢測試劑盒(國產(chǎn))，批號111003;PCV2豬多抗由美國VMRD公司提供;羊抗豬熒光二抗由Thermo公司提供;HRP標(biāo)記的小鼠抗豬IgG二抗由洛陽賽爾維實驗器材有限公司提供;HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG二抗及 TMB由 Sigma公司提供;牛血清白蛋白(BSA)，Ameresco公司;BCA蛋白定量試劑盒，GE公司;酶標(biāo)板，深圳金燦華公司;其他化學(xué)試劑主要來自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司(分析純)。主要設(shè)備有包被機、洗板機、酶標(biāo)儀、恒溫孵育箱、熒光顯微鏡。

1．1．2 PCV2 Cap 蛋白的制備 參見文獻(xiàn)［5］，利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行Cap蛋白表達(dá)，將純化后的蛋白經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒定量后作為檢測用抗原。

1．1．3 PCV2 單抗的制備 參見文獻(xiàn)［5］，應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備分泌PCV2單抗的細(xì)胞株，利用小鼠腹水生產(chǎn)抗PCV2的單克隆抗體，純化后的單抗經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒定量后作為包被用抗體。

1．2 ELISA試劑盒的研制

1．2．1 反應(yīng)條件的確定 按照方陣滴定方法優(yōu)化ELISA反應(yīng)條件，確定PCV2單克隆抗體和抗原的包被濃度。對一抗及二抗的最佳稀釋度和反應(yīng)時間進(jìn)行優(yōu)化。

1．2．2 判定標(biāo)準(zhǔn)的確定 取經(jīng)間接免疫熒光試驗(IFA)檢測抗體陰性和PCR檢測血清抗原陰性的豬血清40份，進(jìn)行ELISA檢測，統(tǒng)計平均OD450nm值和標(biāo)準(zhǔn)差，計算陰陽性值的臨界點。

1．2．3 敏感性、特異性和比較試驗 取經(jīng)IFA檢測抗體陽性的PCV2豬陽性質(zhì)控血清10份、取經(jīng)IFA檢測抗體陰性和PCR檢測血清抗原陰性的陰性質(zhì)控血清10份和PCV1陽性豬血清、PRRSV陽性豬血清、CSFV陽性豬血清、PPV陽性豬血清、PRV陽性豬血清各1份，共25份血清用本研究試劑盒進(jìn)行ELISA檢測，分析試劑盒敏感性和特異性。取178份豬血清樣本用本研究試劑盒和IFA方法及商品化進(jìn)口和國產(chǎn)兩種試劑盒分別進(jìn)行檢測，分析符合率。

1．2．4 試劑盒組裝、重復(fù)性及保存期試驗 試劑盒由96孔抗原包被板、陽性和陰性對照血清、小鼠抗豬IgG酶標(biāo)二抗、顯色液A和B及終止液和10倍濃縮洗滌液組成。取3個不同批次的試劑盒，每批5個，分別檢測PCV2陽性豬血清和陰性豬血清，計算批內(nèi)及批間變異系數(shù)(CV)。將試劑盒置2～8℃保存，不同時間取樣檢測保存期。

1．2．5 人工免疫血清檢測 選取21日齡非免疫健康易感仔豬30頭，PCR檢測血清PCV2病毒陰性，ELISA檢測血清抗體效價低于1∶50。用本實驗室研究的基因工程疫苗及全病毒滅活疫苗及三種商品化疫苗(進(jìn)口PCV2基因工程疫苗和國產(chǎn)全病毒滅活疫苗1及國產(chǎn)全病毒滅活疫苗2)進(jìn)行常規(guī)免疫，每種疫苗免疫5頭，留5頭做空白對照，免疫后28 d采血進(jìn)行ELISA檢測。

2 結(jié)果

2．1 ELISA反應(yīng)條件的確立 確定單抗最佳包被濃度為2μg/mL，每孔100μL，4℃孵育過夜，封閉液1%BSA，每孔200μL，37℃封閉2 h后包被抗原，抗原最佳包被濃度為3μg/mL，每孔100μL，4℃孵育過夜，一抗1∶100稀釋，每孔100μL，37℃反應(yīng)45min，二抗最佳稀釋度為1∶2000，每孔100μL，37℃反應(yīng)45 min，顯色液A和B每孔各50μL，顯色10 min，2 mol/L硫酸溶液終止，酶標(biāo)儀450 nm讀數(shù)。

2．2 判定標(biāo)準(zhǔn)的確定 使用本試劑盒檢測經(jīng)IFA檢測抗體陰性和PCR檢測血清抗原陰性的健康豬血清40份，求其平均OD450nm值 =0．181;標(biāo)準(zhǔn)差=0．068;按臨界值=陰性樣品平均值+3×標(biāo)準(zhǔn)差計算，其臨界值為0．385。所以待檢血清OD450nm值應(yīng)≥0．4判為陽性，待檢血清 OD450nm值 ＜0．385判為陰性。在0．385≤OD450nm＜0．4 范圍內(nèi)，為可疑，需進(jìn)行第二次檢測，如還在此區(qū)間判為陰性。

2．3 敏感性、特異性和比較試驗結(jié)果 10份陽性質(zhì)控血清的IFA檢測結(jié)果見圖1和表1，10份陽性質(zhì)控血清 ELISA檢測結(jié)果均為陽性，敏感性100%，陽性質(zhì)控血清ELISA檢測最高稀釋倍數(shù)(ELISA效價)可達(dá)1∶3200。10份陰性質(zhì)控血清和5份其他豬病毒抗體陽性血清(PCV1、PRRSV、CSFV、PRV、PPV)的 ELISA檢測結(jié)果均為陰性，特異性100%。178份豬血清樣本的檢測結(jié)果顯示，本研究試劑盒和IFA方法及商品化進(jìn)口和國產(chǎn)兩種試劑盒的總符合率分別為96．63%(172/178)、97．75%(174/178)和 84．27%(150/178)。

圖1 豬血清IFA檢測結(jié)果

表1 陽性質(zhì)控血清ELISA檢測結(jié)果

2．4 重復(fù)性和保存期試驗結(jié)果 取3個不同批次的試劑盒，每批5個，分別檢測PCV2陽性豬血清和陰性豬血清，批內(nèi)變異系數(shù)為2．35% ～4．06%，批間變異系數(shù)為4．87% ～6．54%。保存期試驗結(jié)果表明，2～8℃保存15個月穩(wěn)定。

2．5 人工免疫血清檢測結(jié)果 人工免疫豬血清檢測結(jié)果陽性率均在80%以上，具體結(jié)果見表2。兩種國產(chǎn)全病毒滅活疫苗組分別各有一頭免疫豬抗體呈陰性，分析原因可能與豬個體差異有關(guān)系，各豬產(chǎn)生抗體的時間和抗體水平不盡一致，也可能與疫苗質(zhì)量有關(guān)系。

表2 人工免疫豬血清檢測結(jié)果

3 討論

PCV2抗體檢測對于進(jìn)行PCV2流行病學(xué)調(diào)查、疫苗效果評價及試驗用陰性豬的篩選等具有重要意義。目前，PCV2抗體檢測的常用方法有病毒中和試驗(SN)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、間接免疫熒光試驗(IFA)和免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(IPMA)。SN及IFA和IPMA試驗均需要結(jié)合細(xì)胞及病毒培養(yǎng)來進(jìn)行檢測，費時費力，對操作人員要求高，不適合推廣和普及。本研究利用單抗捕獲包被法建立了一種檢測PCV2抗體的方法，并組裝形成試劑盒。研究結(jié)果表明，試劑盒靈敏度和特異性良好，可重復(fù)性強，2～8℃保存15個月穩(wěn)定。

本試劑盒研制的關(guān)鍵是利用PCV2單克隆抗體捕獲PCV2 Cap蛋白進(jìn)行包被板的制備，利用單克隆抗體的高特異性來進(jìn)一步提高抗原包被板的抗原純度和檢測的敏感性及特異性。Cap蛋白是PCV2病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是檢測該病毒特異性抗體的理想靶抗原。市場上國產(chǎn)同類ELISA試劑盒主要有浙江大學(xué)研制、瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的豬圓環(huán)病毒2－dCap－ELISA抗體檢測試劑盒［6］，該試劑盒中所采用的抗原是原核系統(tǒng)表達(dá)的蛋白［7］。本試劑盒中的Cap蛋白來源于昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，本系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白產(chǎn)量高、表達(dá)的Cap蛋白能獨立地形成病毒樣顆粒［8］，保持天然病毒空間構(gòu)象結(jié)構(gòu)、免疫活性好且產(chǎn)物易純化、反應(yīng)背景低，已在多種動物疫病診斷中得到應(yīng)用［9］。比較試驗結(jié)果表明，本試劑盒與IFA試驗和商品化進(jìn)口試劑盒的總符合率分別為96．63%和97．75%，適合豬場血清抗體檢測，對PCV2流行病學(xué)調(diào)查有重要意義;不同來源疫苗人工免疫血清檢測結(jié)果表明，本試劑盒適合市場上基因工程疫苗和全病毒滅活苗的免疫豬血清抗體的檢測，可用于疫苗效果評價和豬群免疫抗體水平的監(jiān)測。

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