多重PCR在診斷無(wú)癥狀性尿道炎、宮頸炎人群中的臨床應(yīng)用

范世珍，林松青，陳安彬（深圳市福田區(qū)中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518034）

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）、淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，Ng）、生殖支原體（Mycoplasma genitalium，Mg）和陰道毛滴蟲(chóng)（Trichomonas vaginalis，Tv）是引起性傳播疾病（Sexually transmitted disease，STD）最常見(jiàn)的病原體[1-3]。然而，這些病原體感染后往往缺乏典型的臨床癥狀，這給臨床診斷帶來(lái)了一定的困難。對(duì)于無(wú)癥狀性STD患者而言，常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)陰性結(jié)果往往容易導(dǎo)致他們忽視自己的病情，從而成為危害極大的傳染源。因此，本研究旨在評(píng)價(jià)多重PCR技術(shù)在無(wú)癥狀患者的性傳播感染如尿道炎、宮頸炎相關(guān)病原體的篩查中具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集 本文所入選的216例研究對(duì)象為2010年7月至2011年12月本院體檢人群，其中男性124例，女性92例，年齡平均（31.4±10.1）歲，所有研究對(duì)象在納入研究前均自愿參與并進(jìn)行了簡(jiǎn)要的問(wèn)卷調(diào)查。所有研究對(duì)象處于性活躍期且無(wú)臨床癥狀，年齡在20～60歲。性活躍的定義為連續(xù)3個(gè)月內(nèi)有性生活。若3個(gè)月內(nèi)曾有泌尿生殖道感染史，但納入研究時(shí)已被治愈的研究對(duì)象不納入本文研究范圍。

1.2 DNA提取 收集50 ml男性首段尿，女性在婦科醫(yī)生的協(xié)助下使用宮頸拭子標(biāo)本。于室溫離心10 min，棄上清，加入1 ml無(wú)菌PBS重懸。DNA的提取根據(jù)廠家試劑盒提供的方案進(jìn)行。未及時(shí)用于多重PCR的DNA置于-20℃保存。

1.3 多重PCR反應(yīng) 多重PCR的擴(kuò)增按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。本試劑盒中含有Ct等6種病原體保守基因序列中的特異性引物，并含有用于排除標(biāo)本抑制物存在的內(nèi)參PCR mix和陽(yáng)性對(duì)照樣品。本實(shí)驗(yàn)用的PCR儀為Eppendorf公司梯度PCR儀。PCR結(jié)束后電泳觀察結(jié)果，預(yù)期片段處出現(xiàn)反應(yīng)條帶判斷為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 病原體檢出情況 在216例研究對(duì)象中，95例（43.98%）患者泌尿生殖道內(nèi)至少存在一種微生物感染。Ct、Ng、Mg、Uu、Mh和Tv在無(wú)癥狀人群中的感染率見(jiàn)表1。

表1 無(wú)癥狀人群中6種病原體的檢出情況[例（%）]

2.2 混合感染情況 在所有研究對(duì)象中Ct、Ng、Mg和Tv單一感染分別為10例、1例、1例、2例。此外，多重感染也常見(jiàn)，主要是Ct合并Mh或Uu感染。在感染有Ct的人群中，Uu和Mh的感染率分別為27.8%（5/18）和33.3%（6/18）。此外，Mg和Tv與其他細(xì)菌混合感染也常見(jiàn)，見(jiàn)表2。

表2 無(wú)癥狀人群中病原體混合感染情況[例（%）]

3 討論

Ct、Ng、Mg、Tv等是引起無(wú)癥狀性尿道炎、宮頸炎最重要的病原體[4]。在本研究中，這4種病原體的感染率達(dá)12.04%（26/216）。經(jīng)多重PCR鑒定，Ct感染18例，Ng感染2例，Mg感染2例，Tv感染4例。此外，在這216例無(wú)癥狀人群中復(fù)合感染11例。以上結(jié)果表明如果醫(yī)生僅根據(jù)患者的癥狀進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)性治療的話，有可能導(dǎo)致治療失敗。因此，立即進(jìn)行多重檢測(cè)顯得有必要，因?yàn)閷?duì)于多重感染患者而言，可使治療方案最佳化。相對(duì)上述4種病原體，Uu和Mh在STD以及非淋球菌性尿道炎(Nongonococcal urethritis，NGU）中的作用目前仍有爭(zhēng)議。盡管有報(bào)道稱(chēng)Uu可以導(dǎo)致持續(xù)性NGU，但正常人的尿道經(jīng)常可以分離出Uu。Mh目前也被認(rèn)為是人體正常寄生菌，但是它在特定條件下（如免疫力低下）可以作為病原體致病[5-6]。通常，泌尿生殖道中Mh定植的概率，男性是4%～13%，女性是21%～54%[7]。本研究證實(shí)Mh的感染率男性為2.78%，女性11.57%，略低于報(bào)道，這可能與本研究人群的環(huán)境與飲食習(xí)慣有關(guān)。

本文結(jié)果顯示，Uu和Mh的感染率分別為17.59%和14.35%，但若合并Ct感染，其陽(yáng)性率上升為27.8%和33.3%。其原因目前仍不清楚，Ct感染后引起的黏膜損傷可能更有利于Uu和Mh的定植。

在多重PCR的反應(yīng)體系中，由于使用了多對(duì)引物，因此能一次性擴(kuò)增多個(gè)目標(biāo)序列，這為臨床醫(yī)生同時(shí)檢測(cè)許多臨床領(lǐng)域的病原微生物提供了方便。尤其是當(dāng)臨床樣本量極少或難以多次獲取時(shí)，多重PCR可以利用單個(gè)的樣本得到更多的目的片段。Horii等[8]證實(shí)，相比普通PCR，多重PCR總體敏感性是96%，特異性是100%，且不存在其他微生物的交叉反應(yīng)，特別是對(duì)于高危人群(如職業(yè)性工作者)、有多個(gè)性伴侶及免疫力低下人群。通過(guò)運(yùn)用多重PCR，臨床醫(yī)生可以快速鑒定出多種微生物感染，并能對(duì)無(wú)癥狀人群及時(shí)治療，從而可以降低性傳播病原體的感染率。

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