硝/銨營養(yǎng)對香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌生長的影響

張茂星，陳 鵬，張明超，阮云澤，李 榮，朱毅勇*，沈其榮

(1南京農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境科學院，江蘇南京210095;2海南大學農(nóng)學院，海南?？?71101)

香蕉枯萎病又名香蕉巴拿馬病、黃葉病，是一種真菌引起的土傳病害［1］。其病原菌是尖孢鐮刀菌古巴?；?Fusarium oxysporum f.sp.Cubense)，有4個生理小種。自1967年在臺灣首次發(fā)現(xiàn)香蕉枯萎病［2］之后，廣東［3-4］、福建［5］、海南［6］等地也相繼發(fā)生，侵染小種為1號和4號。4號小種主要侵染香牙蕉(AAA)，而我國種植的品種巴西蕉、巴貝多、威廉姆斯，都屬于香牙蕉類，極易感染，因此國內(nèi)大多數(shù)香蕉種植產(chǎn)業(yè)因此而遭受重創(chuàng)。由于該病原菌可通過帶病吸芽、土壤、雨水和氣流等進行傳播，因此蔓延迅速，而且病原菌在土壤中可長期營養(yǎng)兼性寄生生活，一般的化學藥劑難以徹底根除。雖然理論上可以通過培育抗病品種來避免香蕉枯萎病菌的浸染，但是在實踐中周期很長，無法解決當前存在的問題［7］。目前也有不少生物防治［8］的方法，但是由于缺乏相應的理論基礎(chǔ)，還處于摸索階段。

從植物營養(yǎng)學的角度發(fā)現(xiàn)，氮素形態(tài)與含量可以影響很多病原菌的生長。Sabine等［9］研究者在2008年報道，10 mmol/L的銨態(tài)氮可以抑制水稻惡苗病原菌(Fusarium fujikuroi)透性酶MeaB合成比卡霉素，從而降低其致病性。而Talbot［10］早在1993就發(fā)現(xiàn)，在缺少硝態(tài)氮的條件下能夠影響水稻稻瘟病和小麥赤霉病的病原菌侵染，這也被大量的研究者所證實［11-14］，研究認為在缺少硝態(tài)氮時，稻瘟病病原菌的致病基因表達增強。植物病理學研究表明，香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌在致病過程中首先要吸附并定植在植物根系表面，之后穿透細胞壁，最后寄生在植物細胞中生長繁殖，并產(chǎn)生一些次級代謝產(chǎn)物和毒素致使植物維管束堵塞，葉片枯萎，植株死亡［15］。有研究者發(fā)現(xiàn)，在番茄感染相應的尖孢鐮刀菌時，病原菌的菌絲體在穿透植物細胞壁的過程中受到基因的參與，而銨態(tài)氮可以抑制該基因的表達，從而影響其侵染。因此，如何從植物營養(yǎng)的角度來研究并闡明氮素對病原菌生長與侵染的影響，并在實際生產(chǎn)中調(diào)控土壤中的氮素形態(tài)，含量的變化，對于調(diào)控枯萎病的發(fā)生具有重要的理論與實踐指導意義。

而有關(guān)香蕉枯萎病是否受到氮素形態(tài)的影響，及病原菌對氮素的響應機制，到目前為止還未見報道。因此在本研究中，我們利用不同硝銨配比對海南香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌生長的影響進行了研究，并利用生物膜研究了其菌絲體在不同氮素處理下的穿透能力，為實踐中如何通過調(diào)控氮素營養(yǎng)，控制枯萎病提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

香蕉枯萎病病原菌是由南京農(nóng)業(yè)大學江蘇省固體有機廢棄物資源化利用高新技術(shù)研究重點實驗室自行篩選，屬于尖孢鐮刀菌古巴?；?，并經(jīng)過分子鑒定為香蕉枯萎病4號生理小種。

1.2 試驗設計

室內(nèi)培養(yǎng)試驗按照霍格蘭營養(yǎng)液的配方，并加一定量的葡萄糖(見表1)，加入瓊脂(20g/L)后配成固體培養(yǎng)基，其中的氮源設置7個處理:對照，不加氮源(N0+A0);100% 硝態(tài)氮(N100%);75%硝態(tài)氮+25%銨態(tài)氮(N75%+A25%);50%硝態(tài)氮+50%銨態(tài)氮(N50%+A50%);25%硝態(tài)氮+75%銨態(tài)氮(N25%+A75%);100%銨態(tài)氮(A100%)，PDA(potato dextrose agar)。pH 用 tris-HCl調(diào)節(jié)至4或6。分別配置500 mL培養(yǎng)基后分裝100 mL到250 mL三角瓶，高溫高壓蒸汽滅菌30 min。培養(yǎng)基成分按照表1的標準，其中氮源是在培養(yǎng)基滅菌后添加，總氮是10 mmol/L。硝酸鈉和氯化銨溶液分別用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后加入培養(yǎng)基并倒入直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中用直徑為5mm的打孔器接種香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌菌塊1塊。每個處理重復3次，在28℃恒溫培養(yǎng)箱下培養(yǎng)5 d后測菌落直徑。

表1 培養(yǎng)基各組分濃度及硝銨配比Table 1 The concentrations of culture medium components and nitrate/ammonium ratios

在不同濃度銨對尖孢鐮刀菌生長的影響的試驗中，培養(yǎng)基成分除氮源為不同濃度的氯化銨外，其余各組分如上。試驗設8個處理，銨態(tài)氮濃度分別為0、1、2、5、10、15、20、25 mmol/L。

模擬細胞壁穿透試驗的處理方法同上，將總的氮源設為 5和 10 mmol/L，并將滅菌的賽璐膜(cellophane membrane 孔徑 0.22 μm，直徑為 50 mm)先覆蓋在培養(yǎng)基表面并接種一塊直徑為5 mm的香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌。培養(yǎng)4 d后在無菌環(huán)境下將膜取出，第5 d觀察菌落生長情況［16］。

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2003和SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計分析和顯著性水平檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同硝/銨配比和pH對香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌生長的影響

從圖1可以看出，尖孢鐮刀菌在PDA培養(yǎng)基中的生長不受pH影響。然而在不同硝銨配比處理中，低pH(pH=4)時均導致尖孢鐮刀菌的生長受到抑制。在同一pH值條件下，100%銨處理(A100%)中尖孢鐮刀菌的生長與其它硝銨配比處理差異顯著，菌落直徑均小于4 cm。但是在有硝態(tài)氮存在的情況下，尖孢鐮刀菌的生長甚至比PDA處理的生長更好，且差異顯著。雖然在不加氮源的處理中，尖孢鐮刀菌的生長就其菌落直徑而言，與PDA處理差異不顯著，但是菌絲體顏色很淺，菌絲量很少，說明其生長量可能受到氮源不足的影響。

圖1 不同硝銨配比和pH對尖孢鐮刀菌生長的影響Fig．1 The effects of different ammonium/nitrate ratios and pH on FOC4 growth

2.2 不同銨態(tài)氮濃度對香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌生長的影響

通過室內(nèi)恒溫培養(yǎng)5 d后(圖2)尖孢鐮刀菌的菌落直徑基本上都在小于等于5 cm的范圍?？傮w上，尖孢鐮刀菌在全銨培養(yǎng)基上受不同pH的影響較小，差異不明顯。從圖2-III中可以看出，尖孢鐮刀菌的生長在第4 d開始受到抑制，并且在同一pH條件下，銨態(tài)氮濃度大于等于5 mmol/L時，尖孢鐮刀菌的生長受到顯著的抑制，菌落直徑都小于4 cm。其中在pH為4時，銨態(tài)氮濃度為20 mmol/L與25mmol/L的處理差異不顯著，這說明，當銨濃度達到20mmol/L以上時就產(chǎn)生了明顯的抑制效果。

圖2 不同濃度的銨對香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌生長的影響Fig．2 The effects of different ammonium concentrations on FOC4 growth

2.3 不同濃度的硝/銨配比對尖孢鐮刀菌侵染膜的影響

從圖3和圖4可以看出，通過室內(nèi)恒溫培養(yǎng)，尖孢鐮刀菌在不同硝銨配比的情況下侵染賽璐玢(cellophane)存在一定的差異。尖孢鐮刀菌在N100%，N75%+A25%，N50%+A50%，N25%+A75%，PDA處理的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d后揭膜，1d后都長有一定量的菌絲。然而在N0%+A0%和A100%的固體培養(yǎng)基中揭膜1d后都沒有長菌絲。從而可以得出尖孢鐮刀菌在侵染膜的過程中需要氮源，然而銨態(tài)氮可以阻止其侵染穿透。我們還通過不同濃度的氮源試驗，各硝/銨配比的處理都得出了同樣的結(jié)果。

3 討論與結(jié)論

微生物的氮源譜十分廣泛，一般可分為有機氮和無機氮兩大類，其中無機氮主要是硝態(tài)氮和銨態(tài)氮。Schneper［17］等指出真菌可以根據(jù)其周圍環(huán)境中不同種類和數(shù)量的氮源，自動調(diào)節(jié)達到氮源利用的最大化而獲得生存。秦涵淳［18］等發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分中氮對香蕉尖孢鐮刀菌的影響比碳的大。在一定C/N比條件下，有機氮含量越高，菌絲生長越快也越多。但是有關(guān)無機態(tài)氮對真菌生長的影響還不清楚。

在實際生產(chǎn)中，有研究者［19］通過改性石灰氮防治香蕉枯萎病取得一定效果，石灰氮在土壤中分解產(chǎn)生了氰胺類化合物對香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌起到觸殺的效果。我們通過室內(nèi)模擬土壤消毒試驗和大田消毒實驗(未發(fā)表)發(fā)現(xiàn)，一定量的氨水或者碳銨與石灰混合消毒，也可以預防和抑制尖孢鐮刀菌的傳播。這些結(jié)果都說明，一定濃度的銨態(tài)氮可能是抑制香蕉枯萎病生長的一個重要原因。另外，國外的研究者［20］等通過木霉T34在不同硝/銨配比情況下對番茄枯萎病的防控作用中發(fā)現(xiàn)，增加銨的濃度可以減少番茄枯萎病的病情指數(shù)。在本次試驗中，尖孢鐮刀菌在全銨的固體培養(yǎng)基中其生長受到了抑制(圖1)，這與上述研究結(jié)果一致。

圖3 不同濃度的硝/銨配比對尖孢鐮刀菌侵染膜的影響(氮濃度為5mmol/L)Fig．3 Effects of different ammonium/nitrate ratios on the cellophane penetration of FOC4(The nitrogen concentration was 5 mmol/L)

由于植物細胞在吸收銨態(tài)氮時，會同時造成質(zhì)外體及周圍環(huán)境酸化。其原因主要是與NH+4的吸收方式有關(guān)，即NH+4與H+的反向運輸或NH+4脫質(zhì)子化后以 NH3的形式進入細胞［21-22］。因此，銨態(tài)氮抑制香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌的生長究竟是其本身的抑制作用還是由于酸化造成的還不明確。從圖1可以看出，尖孢鐮刀菌在低pH條件下生長受到抑制。林妃［23］等的研究認為尖孢鐮刀菌在pH為6或7時生長最快，低于5或大于8時，則生長均受到一定的抑制，并且其產(chǎn)孢量也減少。這說明，銨態(tài)氮源抑制香蕉尖孢鐮刀菌的生長(圖1)，其中一部分原因也可能是由于銨態(tài)氮吸收后周圍環(huán)境中的pH降低導致的。圖2的結(jié)果進一步說明，當銨態(tài)氮濃度升高后，銨態(tài)氮本身對尖孢鐮刀菌的抑制起主導作用，超過了低pH對尖孢鐮刀菌的影響作用。

圖4 不同濃度的硝/銨配比對尖孢鐮刀菌侵染膜的影響(氮濃度為10 mmol/L)Fig．4 Effects of different ammonium/nitrate ratios on the cellophane penetration of FOC4(The nitrogen concentration was 10 mmol/L)

此外，Snoeijers［24］等在 2000 年就指出，氮源本身也是一些真菌侵染植物寄主細胞時的信號分子，氮代謝會激活致病基因的表達。Di Pietro［25］等在2001年證明了蛋白激酶Fmk1是尖孢鐮刀菌侵染番茄寄主細胞時必不可少的，其表達直接影響到菌絲體穿透細胞壁。2010年 Di Pietro又發(fā)現(xiàn)［16］，在控制Fmk1基因表達的上游轉(zhuǎn)錄因子中有一個bZIP蛋白MeaB受到銨態(tài)氮的影響，并直接抑制了Fmk1的表達，而另一個受銨影響的蛋白激酶TOR也可以直接影響尖孢鐮刀菌侵染番茄。他們發(fā)現(xiàn)銨態(tài)氮可以促進谷氨酰胺和蛋白激酶TOR的合成，從而引起轉(zhuǎn)錄因子MeaB的表達，但是MeaB的表達會抑制Fmk1基因的表達，從而影響病原菌穿透細胞壁。從圖3、圖4中可以看出，隨著銨態(tài)氮比例或是濃度的增加，香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌穿透賽璐玢(cellophane)的菌絲減少，甚至在全銨培養(yǎng)時肉眼幾乎無法觀察到，這與Di Pietro在研究番茄枯萎病時的結(jié)果非常相似［16］。這說明，銨態(tài)氮很可能也通過類似的信號通路影響了香蕉尖孢鐮刀菌穿透植株細胞壁的過程。因此，相關(guān)的分子生物學機制還需要在香蕉尖孢鐮刀菌中進一步深入研究。

綜上所述，銨氮態(tài)在一定程度可以有效地控制香蕉尖孢鐮刀菌的生長與侵染過程，在實踐中可以通過相應的施肥措施來調(diào)控香蕉枯萎病的發(fā)生，但是還需要在大田試驗中進行驗證，這也將是今后研究的一個方向。

［1］ 顏速亮，林電，常春榮，等.反季節(jié)組培香蕉氮、磷、鉀肥料配比施肥時期及其效應研究［J］.熱帶作物學報，2002，23(2):36-39.Yan S L，Lin D，Chang C R et al.The effect and period of N，P，K fertilizer on anti-season cultivation banana［J］.Chin.J.Trop.Crops，2002，23(2):36-39.

［2］ Sun E J，Su H J，Ko W H.Identification of Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4 from soil or host tissue by cultural characters［J］.Phytopathology，1978，68:1672-1673.

［3］ 王璧生，羅啟浩.廣東香蕉的主要病害及其防治［J］.中國南方果樹，1997，26(3):33-36.Wang B S，Luo Q H.The main diseases of Guangdong bananas and its control［J］.South China Fruits，1997，26(3):33-36.

［4］ 劉景梅，王璧生，陳霞，等.廣東香蕉枯萎病菌生理小種RAPD技術(shù)的建立［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學，2004，(4):43-45.Liu J M，Wang B S，Chen X et al.The RAPD technology established of Guangdong banana wilt disease race［J］.Guangdong Agric.Sci.，2004，(4):43-45.

［5］ 林時遲，張紹升，周樂峰，等.福建省香蕉枯萎病鑒定［J］.福建農(nóng)業(yè)大學學報，2000，29(4):465-469.Lin S C，Zhang S S，Zhou L F et al.Identification of banana vascular wilt in Fujian［J］.J.Fujian Agric.Univ.，2004，(4):43-45.

［6］ 周傳波，莊光輝，張世能，等.海南島香蕉兩新病害的調(diào)查及病原菌鑒定［J］.海南農(nóng)業(yè)科技，2003，(3):1-5.Zhou C B，Zhuang G H，Zhang S N et al.Hainan island banana new diseases investigation and two pathogens identified［J］.Hainan Agric.Sci.Technol.，2003，(3):1-5.

［7］ 劉紹欽，梁張慧，黃熾輝，等.抗枯萎病香蕉新品系農(nóng)科1號的選育［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學，2007，1(3):30-33.Liu S Q，Liang Z H，Huang Z M et al.The new strain breeding of NongKe 1 to resistance banana wilt disease［J］.Guangdong Agric.Sci.，2007，1(3):30-33.

［8］ 何欣，郝文雅，沈其榮，等.生物有機肥對香蕉植株生長和香蕉枯萎病防治的研究［J］.植物營養(yǎng)與肥料學報，2010，16(4):978-985.He X，Hao W Y，Shen Q R et al.Effectsvof bioorganic fertilization on growth and controlling fusarium wilt disease of banana［J］.Plant.Nutr.Ferti.Sci.，2010，16(4):978-985.

［9］ Sabine T，Bettina T.Impact of ammonium permeases MepA，MepB，and MepC on nitrogen regulated secondary metabolism in Fusarium fujikuroi［J］.Eukaryottc Cell，2008，7(2):187-201.

［10］ Talbot N J，Hamer J E.Identification and characterization of MPG1，a gene involved in pathogenicity from the rice blast fungus Magnaporthe grisea［J］.Plant Cell，1993，5:1575-1590.

［11］ Coleman M，Arnau J.Starvation induced genes of the tomato pathogen Cladosporium fulvumare also induced during growth in planta［J］.Mol.Plant Microbiol Interact.，1997，10:1106-1109.

［12］ Stephenson S A，Green J R.Cloning and characterisation of glutamine synthetase from colletotrichum gloeosporioides and demonstration of elevated expression during pathogenesis on Stylosanthes guianensis［J］.Curr.Genet.，1997，31:447-454.

［13］ Divon H，Di Pietro A，F(xiàn)luhr R.Nitrogen responsive genes are differentially regulated in planta during Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici infection［J］.Mol.Plant Pathol.，2005，6:459-470.

［14］ Donofrio N M，Dean R A.Global gene expression during nitrogen starvation in the rice blast fungus，Magnaporthe grisea［J］.Fungal.Genet.Biol.，2006，43:605-617.

［15］ 黎永堅，于莉.香蕉枯萎病發(fā)病機制及其防治技術(shù)研究［J］.中國農(nóng)學通報，2006，22(8):515-519.Li Y J，Yu L.The study on the pathogenesis and control of banana vascular wilt［J］.Chin.Agric.Sci.Bull.，2006，22(8):515-519.

［16］ Di Pietro A，Manuel S A.Nitrogen response pathway regulates virulence functions in Fusarium oxysporum via the protein kinase TOR and the bZIP Protein MeaB［J］.Plant Cell，2010，22:2459-2475.

［17］ Schneper L，Duvel K，Broach J R.Sense and sensibility:nutritional response and signal integration in yeast［J］.Curr.Opin.Microbiol.，2004，7:624-630.

［18］ 秦涵淳，楊臘英，黃俊生，等.培養(yǎng)基營養(yǎng)成分對香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌生長的影響［J］.熱帶作報，2009，30(12):1852-1857.Qan H C，Yang L Y，Huang J S et al.Effect of nutrients in medium on growth of Fusarium oxysporum f.sp.cubense causing fusarial wilt on banana［J］.Chin.J.Trop.Crops，2009，30(12):1852-1857.

［19］ 杜志勇，樊小林.改性石灰氮防治香蕉枯萎病及其恢復香蕉生產(chǎn)的效果［J］.果樹學報，2008，25(3):373-377.Du Z Y，F(xiàn)an X L.Results of banana fusarium wilt control and banana reproduction in degraded orchard by use of modified lime nitrogen［J］.J.Fruit Sci.，2008，25(3):373-377.

［20］ Borrero C，Avile's M.Effect of ammonium/nitrate ratio in nutrient solution on control of fusarium wilt of tomato by Trichoderma asperellum T34［J］.Plant Pathol.，2011，10:1365-3059.

［21］ Marschner H，R?mheld V.In vivo measurement of root induced pH changes at the soil root interface:effect of plant species and nitrogen source［J］.Z.Pflanzenernaehr.Bd.，1983，111:241-251.

［22］ Raven J A.Biochemical disposal of excess H+in growing plants?［J］.New Phytol.，1986，104:175-206

［23］ 林妃，高劍，曾會才，等.海南省香蕉枯萎病病原菌的分離鑒定及1號4號小種的生物學特性［J］.基因組學與應用生物學，2010，29(2):314-321.Lin F，Gao J，Zeng H C et al.Isolation and identification of banana vasicular wilt in Hainan province and determination of biological characteristics of strains Focr1 and Focr4［J］.Genomics Appl.Biol.，2010，29(2):314-321.

［24］ Snoeijers S S，De Wit P J.The effect of nitrogen on disease development and gene expression in bacterial and fungal plant pathogens［J］.Eur.J.Plant Pathol.，2000，106:493-506.

［25］ Di Pietro A，Ron cero M I.A MAP kinase of the vascular wilt fungus Fusarium oxysporum is essential for root penetration and pathogenesis［J］.Mol.Microbiol.，2001，39:1140-1152.