拮抗菌強(qiáng)化的生物有機(jī)肥對西瓜枯萎病的防治作用

王小慧，張國漪，李 蕊，盧穎林，冉 煒*，沈其榮

(1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省固體有機(jī)廢棄物資源化高技術(shù)研究重點(diǎn)實驗室，南京210095;2廣州甘蔗糖業(yè)研究所，廣州510316)

西瓜枯萎病是由西瓜專化型尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum f．sp．niveum)引起的，是導(dǎo)致西瓜生產(chǎn)毀滅性損失的土傳病害。隨著市場對西瓜需求量的增長，西瓜種植面積逐年擴(kuò)大，傳統(tǒng)的輪作防病措施難以實行，導(dǎo)致西瓜枯萎病日趨嚴(yán)重。據(jù)在京郊各區(qū)的調(diào)查結(jié)果，一般病株率在10% ～20%，重者達(dá) 80% ～90%，重茬地甚至造成絕產(chǎn)［1－2］。因此，尋找一種安全有效的防治西瓜枯萎病的方法迫在眉睫。

西瓜枯萎病的常規(guī)防治方法有輪作和套作、嫁接、施用化學(xué)農(nóng)藥和采用抗病品種等。輪作和套作是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上常見的防治多種植物病害發(fā)生的有效措施，但由于病原菌的厚垣孢子能在土壤中存活10年左右，而且我國生產(chǎn)者的平均耕地面積小，實施過程難度大，輪作和套作的效果不十分明顯［3］。嫁接大多用南瓜作砧木，但無法解決種子攜帶病原菌的問題，而且西瓜嫁接時根腐病發(fā)生幾率大幅增加［4－5］。多年來高毒農(nóng)藥的使用也使得該病原菌產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性，同時引起土壤、水體和大氣等環(huán)境污染，導(dǎo)致農(nóng)副產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留增加，直接危害人類的健康及生存?？共∮N的研究在實際中也遇到很多困難，如西瓜遺傳基礎(chǔ)狹窄、品種資源匱乏的限制［3］。近年來，人們致力于尋找有效的替代方法，比如生物防治，因其具有對環(huán)境友好、無污染、見效快等優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是綜合防治西瓜枯萎病的措施之一，對生態(tài)平衡和可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有特別重要的意義。

利用拮抗微生物防治土傳病害已有多年的研究并有一定規(guī)模的應(yīng)用，芽孢桿菌是土壤和植物微生態(tài)的優(yōu)勢微生物種群，具有很強(qiáng)的抗逆能力和抗菌防病作用，許多性狀優(yōu)良的天然分離株已成功地應(yīng)用于植物病害生物防治［6］。利用微生物有機(jī)肥防治土傳病害不僅可以向植物根際施入特異性生防菌，抑制病原菌生長繁殖，防止土傳病害的發(fā)生，而且有機(jī)肥能提供豐富的營養(yǎng)，促進(jìn)生防菌在土壤和植物根際定殖，大大提高其生防效果［7］，因此生產(chǎn)中人們已經(jīng)開始利用枯草芽孢桿菌［8］、短小芽孢桿菌［9］、解淀粉芽孢桿菌和吉氏芽孢桿菌［10］等來防治土傳病害。葡聚糖是構(gòu)成真菌細(xì)胞壁的主要成分之一，葡聚糖酶可以降解真菌的細(xì)胞壁，具有抗真菌和植物病原菌的活性［11］，因而篩選出既能降解病原菌細(xì)胞壁，又能給植物增加養(yǎng)分的拮抗菌對生產(chǎn)顯得尤為重要。類芽孢桿菌可產(chǎn)生具有抗菌活性的蛋白質(zhì)，且大多數(shù)為核糖體合成的細(xì)胞壁降解酶類，如β－1，3－葡聚糖酶，該酶可水解β－1，3－葡聚糖中的β－1，3－糖苷鍵，從而抑制植物病原真菌的生長與增殖，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性［12－13］。還能通過固氮和溶磷作用為宿主植物提供營養(yǎng)成分［14］，促進(jìn)植株生長。

本研究通過從健康土樣中分離篩選對西瓜枯萎病病原菌有不同生防效果的菌株，經(jīng)平板對峙和抑菌譜實驗挑取2株用于制備微生物有機(jī)肥，研究其在溫室盆栽條件下的生防效果，最終獲得一株在西瓜苗期能高效拮抗枯萎病的菌株，同時分析其潛在的防治機(jī)理，包括拮抗菌對土壤微生物區(qū)系的改善和β－葡聚糖酶基因的檢測與克隆，以期為西瓜枯萎病專用微生物有機(jī)肥在生產(chǎn)上的有效施用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

分離拮抗菌的土樣分別采自江蘇南京美齡宮、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)菜園、金壇市連續(xù)15年秸稈還田地塊和施用蚯蚓糞的田間土壤的作物根際，土壤樣品采集后低溫保存帶回實驗室，4℃冰箱保存待用。營養(yǎng)缽育苗采用江蘇宜興陸平村的健康水稻土，未種植過西瓜。盆栽試驗土樣采自江蘇連云港西瓜枯萎病發(fā)病嚴(yán)重的大棚(第2年死亡率達(dá)100%)，采取表層0—30 cm砂土，保持土壤濕潤，封閉在袋中。用稀釋平板法計出連作土壤中尖孢鐮刀菌的數(shù)量達(dá)104cfu/g(按干土計算)。

西瓜品種為感病品種早佳84－24，由新疆昌吉州西亞種子有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

供試病原菌株有西瓜枯萎病菌(F．oxysporum f．sp．niveum)、棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)、甜瓜枯萎病菌(F．oxysporum f．sp．melonis)、香蕉枯萎病菌 (F．oxysporum f．sp．cubense)、煙 草 疫 霉(Phytophthora parasitica var．nicotiana)，均為本實驗室保存菌種。

1.2 培養(yǎng)基

尖孢鐮刀菌選擇培養(yǎng)基:KH2PO41.0 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)e-Na-EDTA 0.01 g，L－天門冬酰胺2.0 g，D－半乳糖 20.0 g，蒸餾水1000 mL(121℃滅菌、20 min)。

抗生素類物質(zhì):二硝基苯(75%WP)1.0 g，牛膽汁0.5 g，Na2B4O7·10H2O 1.0 g，硫酸鏈霉素 0.3 g。培養(yǎng)基用10%磷酸調(diào)節(jié)pH至3.8±0.2。

枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基:NaCl 33.0 g，葡萄糖0.8 g，放線菌酮 4.5 mg，多粘菌素 22.5mg，V8汁 326 mL，用蒸餾水定容至1000 mL，pH 5.2。

改良LB液體培養(yǎng)基即在普通LB培養(yǎng)基中加入0.5%的蔗糖。

β－葡聚糖培養(yǎng)基:蛋白胨1.0 g，牛肉浸膏0.5 g，NaCl 0.5 g，β － 葡聚糖 0.005 g，剛果紅 0.01 g ，pH 7.0。

PDA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基配方見參考文獻(xiàn)［15］。

1.3 拮抗細(xì)菌的分離與純化

稱取土樣10 g加入裝有90 mL無菌水的三角瓶中(內(nèi)裝玻璃珠若干)，30℃、170 r/min振蕩30 min，靜止后取土壤懸液稀釋至10－3、10－4、10－5均勻涂布于PDA培養(yǎng)基，每個梯度設(shè)3個重復(fù)。將西瓜枯萎病病原菌(LD)保藏種進(jìn)行活化，用打孔器(直徑5mm)在菌落邊緣區(qū)域打孔制成菌片，轉(zhuǎn)接至已涂布有土壤稀釋液的PDA平板中央，25℃培養(yǎng)72 h，用無菌接種針挑取有拮抗效果的菌落于NA培養(yǎng)基進(jìn)行劃線純化。采用對峙法將單菌落點(diǎn)接在距病原菌菌片20 mm處，每皿接種2個菌株，對角線為同一菌株(此為1個重復(fù))，每株病原菌做3個重復(fù)同時設(shè)空白對照(不接菌)。28℃培養(yǎng)6 d，測量抑菌帶和抑菌圈直徑。

1.4 抑菌譜試驗

取本實驗室保藏的不同病原菌菌株進(jìn)行活化，用滅菌打孔器(直徑5 mm)在菌落邊緣區(qū)域打孔制成菌片，轉(zhuǎn)接至PDA平板中央，28℃培養(yǎng)24 h，采用對峙法將抑菌效果較好的菌株點(diǎn)接在距病原菌菌片20 mm處，每皿接種2個菌株，對角線為同一菌株，每株病原菌做3個重復(fù)，同時設(shè)空白對照(不接菌)。25℃培養(yǎng)6 d，測量病原菌的菌落直徑、抑菌圈直徑，計算抑菌率。

抑菌率(%)=(對照病原菌直徑－與拮抗菌對峙的病原菌直徑)/對照病原菌直徑×100

1.5 溫室盆栽拮抗試驗

1.5.1 生物有機(jī)肥制備 根據(jù)江蘇新天地生物肥料有限公司制備拮抗土傳病害微生物有機(jī)肥工藝，分別將2種功能菌CR38和Cy5的菌株懸浮液按20%(V/W)的量加入到腐熟好的有機(jī)肥(以豬糞與氨基酸有機(jī)肥按質(zhì)量比1∶1混合制成。菜粕氨基酸有機(jī)肥料，含有機(jī)質(zhì) 442g/kg、氨基酸 80 g/kg、N 44 g/kg、P2O535 g/kg、K2O 6.7 g/kg，水分 28.5%。豬糞堆肥含有機(jī)質(zhì) 534g/kg、N 36 g/kg、P2O547g/kg、K2O 11 g/kg、水分28.5%)中，發(fā)酵堆肥制成生物有機(jī)肥 BIO38、BIO5。

1.5.2 營養(yǎng)缽育苗的盆缽試驗設(shè)計 按干土重量的2%施肥，共設(shè)3個處理:1)健康土壤+未接入功能菌的有機(jī)肥(簡稱營養(yǎng)缽CK);2)健康土壤+生物有機(jī)肥BIO38(簡稱營養(yǎng)缽BIO38);3)健康土壤+生物有機(jī)肥BIO5(簡稱營養(yǎng)缽BIO5)。

西瓜種子用5%NaClO溶液消毒2 min，再用無菌水沖洗3遍，于28℃培養(yǎng)箱避光催芽露白。播種于一次性小杯中，進(jìn)行營養(yǎng)缽育苗。每個杯子中加入300 g健康土壤，每個處理重復(fù)25次，播種前將肥料與土壤要充分混勻。營養(yǎng)缽苗期試驗于2011年4月25日至同年5月10日(15 d)在溫室進(jìn)行。1.5.3盆栽試驗設(shè)計 按干土重量的0.5%施肥，共設(shè)3個處理:1)連作土壤+營養(yǎng)缽CK+未接入功能菌的有機(jī)肥(CK對照);2)連作土壤+營養(yǎng)缽BIO38+生物有機(jī)肥BIO38(BIO38);3)連作土壤+營養(yǎng)缽BIO5+生物有機(jī)肥BIO5(BIO5)

每個盆缽裝5 kg西瓜枯萎病發(fā)病嚴(yán)重的連作土壤，每個處理重復(fù)25次，所有處理施肥總量相等。待營養(yǎng)杯中的西瓜幼苗第2片真葉徹底展開，將幼苗連同杯中土壤一起移入大盆缽中，常規(guī)水肥管理。盆栽種植20 d后，計算發(fā)病率和防治效果，分級標(biāo)準(zhǔn)［16］根據(jù)植株整株葉片、莖梗、枯萎或壞死的面積而定:0=0%，1=1～33%，2=30% ～66%，3=67%～100%，4=全株死亡。病情指數(shù)(DSI)=Σ(病害的級別×該級別的植株數(shù))/供試植株數(shù);發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/重復(fù)數(shù)×100%;防治率=(對照發(fā)病率－處理發(fā)病率)/對照發(fā)病率×100%。

采集各處理發(fā)病程度接近的植株測定西瓜株高及生物量。抖落所有粘在西瓜植株根系上的土壤后，將根稱重，按每克根加9 mL無菌水的比例放入事先裝有玻璃珠的試管中，再將試管放置在渦旋儀上渦旋5 min，洗脫在無菌水中的土壤即為根際土壤，分別采用NA培養(yǎng)基、枯草芽孢桿菌選擇性培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基、尖孢鐮刀選擇性培養(yǎng)基對其中的細(xì)菌、芽孢桿菌、放線菌、真菌、尖孢鐮刀菌進(jìn)行稀釋平板計數(shù)。各種微生物的數(shù)量以烘干基計算。

1.6 菌株Cy5的β－葡聚糖酶活定性檢測和基因分析

將Cy5接種在β－葡聚糖培養(yǎng)基平板上，每個平板點(diǎn)接2個單菌落，重復(fù)3次，30℃培養(yǎng)3 d。觀察其在β－葡聚糖培養(yǎng)基上產(chǎn)生水解圈的情況，同時測量水解圈的直徑大小，用于定性分析指示Cy5菌株產(chǎn)β－葡聚糖酶的能力。采用PCR法檢測拮抗菌β－葡聚糖酶的基因。提取細(xì)菌的DNA，以其為模板擴(kuò)增拮抗基因。PCR擴(kuò)增引物［17］F端為5－TTGCGAATGTGTTCTGGGAACC－3，R端為 5－TACTAATTGCTCGTATATTTTACCCA －3，目的片段大小為600 bp。PCR反應(yīng)體系為:模板DNA 1μL，上游、下游引物各 1 μL，dNTP 2 μL，10 × PCR 反應(yīng)緩沖液 2.5 μL，MgCl22.5 μL，Taq 酶(Promega)0.3 μL，ddH2O 14.7 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min，95℃變性 1 min，55℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，共33個循環(huán);最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，再將產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后送金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行同源性比較，采用 MEGA version 4.1軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.7 菌株Cy5的鑒定

菌株的常規(guī)形態(tài)觀察、革蘭氏染色和生理生化鑒定參照文獻(xiàn)［18］。菌株的16S rDNA序列分析:提取細(xì)菌的總DNA［19］，然后采用細(xì)菌的16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR體外擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增引物F為5’－ AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG－ 3’，R為5’－AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA － 3’［20］，由金斯瑞生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為:模板 DNA 1 μL，上游、下游引物各 1 μL，dNTP 4 μL，10 × PCR 反應(yīng)緩沖液 5 μL，MgCl25 μL，Taq 酶(Promega)0.5 μL，ddH2O 32.5μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性 2 min;94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，共 32個循環(huán);最后 72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒(Axyprep DNA Gel Extraction Kit Axygen Biosciences)純化后pMD19－T-vector連接。16℃連接10 h，轉(zhuǎn)化E．coli DH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，隨機(jī)挑選陽性克隆，酶切質(zhì)粒DNA驗證后，送金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果在NCBI分子生物學(xué)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性檢索。選擇15條相近的序列(同源性在 99%以上)，采用 MEGA version 4.1軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Microsoft Excel作圖，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，不同處理間差異顯著性檢驗采用鄧肯氏新復(fù)極差法，顯著性水平為P≤0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選結(jié)果

從4份根際土壤中分離純化到對西瓜枯萎病菌有潛在拮抗作用的細(xì)菌有172株。通過平板對峙法復(fù)篩獲得抑菌圈直徑＞1cm，抑菌率在60%以上拮抗細(xì)菌有13株，占所有菌株的7.56%;其中Cy5、CR38的抑菌帶寬度≧4 mm，抑菌圈直徑＞2 cm，對病原菌菌絲的生長有較強(qiáng)抑制作用(表1)。

2.2 拮抗菌株Cy5與CR38對其它病原菌的抗性

為了研究篩選獲得拮抗菌株的生防潛力，采用對峙生長法對其抗菌譜進(jìn)行測定。結(jié)果顯示Cy5與CR38對供試病原菌有較好的拮抗效果(表2)。其中對香蕉枯萎病菌，甜瓜枯萎病菌，棉花黃萎病菌的抑菌圈直徑＞2 cm，抑制率都在50%以上。棉花黃萎病菌生長速度非常緩慢，第10 d，抑菌帶＞5 mm，因沒有形成抑菌圈而無法測量。Cy5對煙草疫霉菌抑制率為50%，而CR38對煙草疫霉菌沒有抑制作用。

表1 分離菌株對西瓜枯萎病病原菌生長抑制作用Table 1 Antagonism reaction of strains against the pathogen of watermelon wilt

表2 拮抗菌株對不同病原菌的拮抗效果Table 2 Angatonistic bacteria inhibition against different pathogens

2.3 拮抗菌株Cy5與CR38對西瓜枯萎病的生防效果

溫室盆栽試驗結(jié)果表明，菌株Cy5與 CR38對西瓜枯萎病都有一定的防治效果。到收獲期CK處理的發(fā)病率為64%，BIO38處理的發(fā)病率為48%，BIO5為16%。BIO5處理的生防效果達(dá)75%，而BIO38處理的生防效果只有25%。與CK對照相比，BIO5處理植株的株高、地上部鮮重、地上部干重都達(dá)到顯著水平，分別增加64.8%、63.0%、50%。BIO38處理的株高比CK對照增加54.9%，地上部鮮重，地上部干重都沒有達(dá)到顯著水平(表3)。

施用不同菌株二次發(fā)酵的微生物有機(jī)肥對根際土壤微生物影響不同(表4)。與CK相比，BIO5處理根際土壤的細(xì)菌和枯草芽孢桿菌數(shù)量均顯著增加，真菌與尖孢鐮刀菌的數(shù)量有所下降，放線菌變化不大;BIO38處理根際土壤的枯草芽孢桿菌和放線菌的數(shù)量明顯多于對照，其它三種微生物沒有明顯差異。BIO5處理根際土壤的細(xì)菌和枯草芽孢桿菌數(shù)量分別比CK增加48.5%和61.1%;真菌和尖孢鐮刀菌的數(shù)量分別下降52.1%、70.2%，而放線菌的數(shù)量沒有顯著差異。BIO38處理根際土壤的枯草芽孢桿菌和放線菌的數(shù)量分別比CK增加41.3%和31.3%，而細(xì)菌、真菌、尖孢鐮刀菌的數(shù)量變化不明顯。

表3 微生物有機(jī)肥對西瓜枯萎病的生防效果和對植株生長的影響Table 3 The effect of bio-organic fertilizer on control efficiency watermelon wilt and plant growth of water melon seedling

表4 施用微生物有機(jī)肥對根際土壤微生物的影響(cfu/g，soil)Table 4 Effects of bio-organic fertilizer on soil microbial population of watermelon rhizosphere

2.4 菌株Cy5的鑒定

在NA平板上，30℃生長24 h后的Cy5菌落呈乳白色，不透明，表面濕潤，邊緣光滑且粘稠。在水瓊脂的菌落很薄，常呈阿米巴狀擴(kuò)展。鏡檢為桿狀，革蘭氏G+，產(chǎn)芽孢、橢圓型。菌株的生理生化特征如下:發(fā)酵葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、甘露糖、麥芽糖、木糖、纖維二糖、棉子糖、乳糖和甘露醇產(chǎn)酸，能水解淀粉，能利用尿素。苯丙氨酸反應(yīng)、葡萄糖酸鹽、檸檬酸鹽利用和硝酸鹽還原反應(yīng)均為陰性。產(chǎn)糊精實驗，V－P(Voges-Proskauer)反應(yīng)、甲基紅(M．R)反應(yīng)均為陽性。菌株Cy5的生理生化特征與Paenibacillus jamilae生理生化特征基本一致。16S rDNA序列分析表明，Cy5與P．jamilae的相似性最高，初步認(rèn)為其為P．jamilae，在NCBI上序列登陸號為JQ323092(圖1)。

2.5 菌株Cy5的β－葡聚糖酶定性檢測和基因分析

通過平板試驗法檢測發(fā)現(xiàn)，Cy5可在含β－葡聚糖平板上產(chǎn)生很明顯的水解圈，平均直徑為2.5 cm(圖2)。以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，發(fā)現(xiàn)有一條介于500～750 bp之間的特異性條帶，與預(yù)計大小一致。該序列與已登陸的多粘芽孢桿菌(AY164457)(P．polymyxa AY164457)的 β －1，3－1，4－glucanase同源性達(dá)99%。

3 討論

人們過分追求高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和高效而改變傳統(tǒng)的種植制度導(dǎo)致的生態(tài)失衡是當(dāng)前土傳病害加劇發(fā)生的主要原因［21］。尤其是西瓜、甜瓜等在連作一年后就會發(fā)生枯萎?。?2］。尖孢鐮刀菌是一種典型的土壤習(xí)居菌，屬于兼性寄生菌，寄主范圍廣。至今已報道的尖孢鐮刀菌?；陀?0多種［23］，其中瓜類枯萎病菌有8個?；?。幼苗期其它專化型可侵害非自身寄主，發(fā)生交叉感染，如尖孢鐮刀菌甜瓜?；涂汕秩疚鞴现仓暌鹂菸F(xiàn)象［24］。因此，在西瓜枯萎病的生物防治中，必須要篩選到同時抑制多種病原真菌才能提高防治效果。菌株Cy5與CR38不僅對西瓜枯萎病菌有較強(qiáng)的抑制作用，同時對香蕉枯萎病菌、甜瓜枯萎病菌和棉花黃萎病菌都有拮抗效果。Cy5還對煙草疫霉也有作用，說明菌株Cy5有較大的生防潛力。

土壤微生物是土壤中最活躍的肥力因子之一，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中占重要位置，對土壤結(jié)構(gòu)的改善和養(yǎng)分積累、轉(zhuǎn)化以及維持和促進(jìn)植物生長起重要作用［25］。根際有非常復(fù)雜的微生物群體，其中包括病原菌和有益微生物等。細(xì)菌是土壤物質(zhì)轉(zhuǎn)化的主要動力，在土壤中占絕對優(yōu)勢。放線菌產(chǎn)生抗生素和激素類物質(zhì)，有利于抑制有害微生物的生長。真菌雖在物質(zhì)分解中也起重要作用，但一些真菌與土傳病害有關(guān)。所以土壤中細(xì)菌、放線菌數(shù)量與土壤養(yǎng)分含量及作物產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)，而真菌數(shù)量與養(yǎng)分含量之間相關(guān)性較差［26］。在連作生態(tài)系統(tǒng)中，原有的微生物群體之間的平衡被打破，取而代之的是有益細(xì)菌數(shù)目減少，真菌不斷增加［27］。因此，在防治土傳病害的過程中，不僅要減少土傳病原菌和真菌的數(shù)量，而且要提高有益細(xì)菌和放線菌的數(shù)量，使微生物區(qū)系向著健康和諧的方向發(fā)展。本實驗從根際分離到2株拮抗細(xì)菌在西瓜枯萎病苗期防治表現(xiàn)出不同的效果，從溫室效果來看，拮抗菌Cy5在防病促生方面的作用優(yōu)于CR38。BIO5處理的防治率高達(dá)75%，具有對植株生長的促進(jìn)作用十分明顯。BIO5處理根際土壤的細(xì)菌和枯草芽孢桿菌數(shù)量均比CK對照顯著增加，而真菌和尖孢鐮刀菌的數(shù)量大幅下降。BIO38處理根際土壤的枯草芽孢桿菌和放線菌的數(shù)量也顯著增加，但真菌和尖孢鐮刀菌的數(shù)量與CK對照沒有明顯變化，說明增施用菌株Cy5發(fā)酵好的微生物有機(jī)肥有使連作土壤的微生物區(qū)系朝著更健康發(fā)展的潛力。

β－1，3－1，4－葡聚糖酶可以降解真菌的細(xì)胞壁，顯示抗真菌和植物病原菌的活性，對其研究已引起了廣泛的關(guān)注。姚烏蘭等［13］從多粘類芽孢桿菌WY110的分泌物中分離得到了β－1，3－1，4－葡聚糖酶，并驗證了此酶具有抗稻瘟病菌活性;文鳳云等［28］發(fā)現(xiàn)重組β－1，3－1，4－葡聚糖酶對香蕉炭疽病菌、荔枝炭疽病菌、出芽短梗霉以及尖孢鐮刀菌菌絲生長具有很強(qiáng)的抑制作用。劉玉嶺等［29］認(rèn)為重組溶菌酶L27沒有抑菌活性，而重組β－1，3－1，4－葡聚糖酶則有輕微的抑菌活性，但兩個重組蛋白的混合物卻比單一組分的抗菌活性高，表現(xiàn)協(xié)同作用。本試驗分離到的Cy5菌株具有促生抗病作用，同時還能產(chǎn)生多粘類芽孢桿菌的β－1，3－1，4－葡聚糖酶，該蛋白是拮抗菌發(fā)酵液中抗真菌活性組分或其中之一［28］，對真菌生長抑制的活性作用提示其可作為農(nóng)業(yè)抗病蟲害新型藥物進(jìn)行開發(fā)研究。此外，β－l，3－l，4－葡聚糖酶還是一種極具經(jīng)濟(jì)價值的工業(yè)用酶，該酶在飼料工業(yè)上可有效提高動物對飼料的利用率和飼料營養(yǎng)的吸收效率［30］，在啤酒生產(chǎn)中加入該酶可解決β－葡聚糖引起的大麥難降解、黏度大的問題，以提高啤酒的質(zhì)量與穩(wěn)定性［31－32］，說明 β －1，3 －1，4 － 葡聚糖酶具有廣泛的應(yīng)用前景。

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