單增李斯特菌穿越生理屏障機制的研究進展

高 凡，鄭文亞,2，劉 犇,2，董熙奇，張億銀

單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes, LM)屬革蘭陽性菌，1926年首次從被感染的兔子和豚鼠中發(fā)現(xiàn)，在20世紀70年代被確認為一種人獸共患疾病的病原。在80年代被確定為一種食源性病原體，是食品加工業(yè)中主要的污染源之一。該菌對惡劣環(huán)境的抵抗能力強，能夠在高鹽、低pH和低滲條件下生存，還能在4 ℃左右的溫度下生長[1-2]。在致病方面，LM對宿主腸道屏障、胎盤屏障、血腦屏障(Blood Brain Barrier，BBB)的侵襲作用是導(dǎo)致感染的關(guān)鍵事件，感染后可使免疫力低下的動物發(fā)生細菌性敗血癥、腦膜炎、流產(chǎn)等病理癥狀[3]。目前雖然關(guān)于LM介導(dǎo)的致病性方面研究較多并取得了一定的成果，但在感染機制方面的研究較少，尤其對3種生理屏障的侵襲機制還有待深入探索。本文將對LM侵襲機制的研究進展進行綜述，為進一步研究LM致病機理提供一定參考。

1 LM對不同生理屏障的侵襲

1.1 對腸道屏障的侵襲 腸道屏障是阻止腸道病原體感染的第一道防線，在抵御腸道內(nèi)大量細菌及其代謝產(chǎn)物的入侵、維持機體內(nèi)環(huán)境相對穩(wěn)定方面具有重要作用。LM則能通過不同途徑進入腸上皮細胞，然后依靠淋巴循環(huán)和血液循環(huán)傳播至靶器官，進而介導(dǎo)對多個組織臟器的侵襲，如大腦、胎盤等[4]。研究表明，LM對腸道屏障侵襲方式復(fù)雜多樣，可通過粘附蛋白(Listeria adhesion protein, LAP)、內(nèi)化素A(Internalin A, InlA)及腸道M細胞等途徑介導(dǎo)內(nèi)化[5]。LAP、InlA均為LM表面粘附蛋白，其中LAP可通過與上皮細胞表面熱休克蛋白60(Heat shock protein 60，HSP60)作用，介導(dǎo)胞漿中的IKK反應(yīng)，激活NF-kB通路[6]。此外，NF-kB通路還將激活肌球蛋白輕鏈激酶(Myosin light-chain kinase, MLCK)，從而導(dǎo)致肌球蛋白輕鏈(myosin light chain, MLC)磷酸化，使連接蛋白、鈣粘蛋白、網(wǎng)格蛋白重排，進而打開緊密連接，導(dǎo)致LM進一步感染[7-8]。同時該過程還將導(dǎo)致促炎癥因子TNF-α、IL6、IL8的大量分泌，誘發(fā)炎癥反應(yīng)。InlA由800個氨基酸構(gòu)成，包含一個由15個亮氨酸構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域(leucine-rich repeats，LRR)。在LRR區(qū)域的下游，存在一個重復(fù)區(qū)域，該區(qū)域?qū)RR區(qū)域與鈣粘蛋白的結(jié)合至關(guān)重要[9]。InlA通過與鈣粘蛋白(E-cadherin)直接作用介導(dǎo)內(nèi)化，同時誘導(dǎo)其泛素化和磷酸化，促進鈣粘蛋白的招募，提高內(nèi)化效率。InlA介導(dǎo)的內(nèi)化作用被認為是LM穿越腸道屏障的主要途徑，而內(nèi)化素B(Internalin B, InlB)在入侵腸道屏障過程中則不發(fā)揮作用[10]。此外，InlA與鈣粘蛋白在相互作用上存在物種特異性，如InlA不能與小鼠的鈣粘蛋白結(jié)合，但能夠與人、兔細胞表達的鈣粘蛋白結(jié)合并發(fā)生內(nèi)化作用[11]。這是因為構(gòu)成小鼠鈣粘蛋白的第16個氨基酸是谷氨酸，而在LM感染模型中，鈣粘蛋白第16位氨基酸為脯氨酸，對其N-端結(jié)構(gòu)域測定結(jié)果顯示脯氨酸直接參與了與InlA的相互作用。同時，LM還能在腸道杯狀細胞與上皮細胞之間的交界位置侵入，從而穿越腸道屏障[12-13]。

而在以M細胞為通道的侵襲過程中，LM通過感染Peyer氏結(jié)(Peyers patch，PP)中的CX3CR1+細胞，介導(dǎo)并產(chǎn)生促炎癥因子IL-23、IL-12。而IL-23將誘導(dǎo)固有淋巴細胞(Innate lymphocyte 3, ILC3)和γαT細胞分別產(chǎn)生IL-22、IL-17，其中IL-17將繼續(xù)誘導(dǎo)gp38+基質(zhì)細胞產(chǎn)生IL-11，而IL-11與IL-22對上皮細胞的STAT3過程具有協(xié)同促進作用[14]。此外，IL-12與ILC1細胞相互作用，將激活I(lǐng)FN-γ通路，從而誘導(dǎo)STAT1過程。而STAT3與STAT1過程促使腸上皮細胞增殖，并且提高杯狀細胞中鈣粘蛋白的表達量，從而使LM依賴InlA介導(dǎo)的內(nèi)化作用增強[15-16]。另有研究表明，缺失InlA和LAP并不能顯著阻止LM的內(nèi)化效率，這提示在對腸道的侵襲中可能還存在其他重要的未知途徑[17]。

1.2 對胎盤屏障及BBB的侵襲 胎盤屏障對于胎兒正常發(fā)育、阻止微生物入侵等方面具有重要作用。但胎盤屏障相對于腸道屏障在免疫功能方面存在較大區(qū)別，如免疫細胞的數(shù)量和種類[18]。腸道屏障存在大量免疫細胞，而胎盤屏障則缺乏，這種差異使胎盤組織對病原微生物的清除能力顯著低于腸道組織，給高毒力、高侵襲的病原微生物的大量定殖和復(fù)制提供了機會[19]。

Disson O等[20]通過動物模型研究表明，LM在侵襲胎盤的過程中，InlA、InlB存在相互依賴關(guān)系。進一步研究表明，宿主細胞中PI3激酶(PI3 kinase)的活性強度是影響InlA與InlB之間協(xié)同作用的關(guān)鍵，以InlA的侵襲方式受到細胞內(nèi)PI3激酶活性水平的影響。PI3激酶在胎盤組織細胞中活性較低，InlB可通過與肝細胞生長因子(Met)的相互作用，顯著提高PI3激酶的活性水平，從而導(dǎo)致肌動蛋白骨架重排，使InlA得以完成對胎盤細胞的入侵[21]。同時，InlA無法獨立完成對胎盤細胞的侵襲，而InlA與鈣粘蛋白的相互作用是InlB發(fā)揮作用的先決條件[22]。另有研究表明，LM分泌蛋白InlP在介導(dǎo)胎盤侵襲過程中同樣具有重要作用，InlP是LM產(chǎn)生的一種分泌蛋白，能夠與胎盤組織中的絲狀肌動蛋白(Afadin)結(jié)合，使LM介導(dǎo)對胎盤組織的侵襲[23]。與此同時，InlP與絲狀肌動蛋白之間的作用強度與Ca2+濃度相關(guān)，胞質(zhì)中的Ca2+濃度變化可能導(dǎo)致InlP構(gòu)型發(fā)生變化，通過影響InlP的活性增強InlP與絲狀肌動蛋白結(jié)合能力，這可能與InlP結(jié)構(gòu)中132-136氨基酸之間的環(huán)形結(jié)構(gòu)與Ca2+存在一定的親和力有關(guān)[24]。絲狀肌動蛋白定位于胞間連接處，在細胞表面并不表達，而在含有核蛋白的細胞間連接的胞質(zhì)中表達豐富，同時在維持細胞極化、遷移等方面發(fā)揮重要作用[25]。研究表明，胎盤組織細胞中PI3激酶活性水平顯著低于腸道細胞，而在PI3激酶高表達的腸道細胞中InlA就足以介導(dǎo)內(nèi)化，這解釋了內(nèi)化素B為何在對腸道的侵襲中不發(fā)揮作用[26-27]。LM在腸道和胎盤屏障中的內(nèi)化差異，顯示胎盤組織對抵御病原菌侵襲具有天然、高效的保護作用，反映了哺乳動物在應(yīng)對病原菌感染存在協(xié)同進化特點。見圖1。

圖1 InlA與InlB在腸道組織和胎盤組織細胞中的協(xié)同作用差異

BBB維持著腦部微環(huán)境的動態(tài)穩(wěn)定，緊密連接、腦毛細血管網(wǎng)和極化的微血管內(nèi)皮細胞共同維持了BBB結(jié)構(gòu)和功能的完整性，同時也是抵御病原微生物侵入的關(guān)鍵屏障[28]。LM可通過血液循環(huán)和淋巴循環(huán)介導(dǎo)對BBB的定殖和侵襲，從而導(dǎo)致嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。研究表明，InlA與InlB在對BBB的侵襲過程中也可能存在相互依賴關(guān)系，但這種依賴作用是否受到PI3激酶活性的影響還需要進一步研究[29]。此外，在BBB多種細胞上發(fā)現(xiàn)HSP60的表達，這提示LAP也可能在侵襲過程中發(fā)揮作用。另有研究表明，內(nèi)化素F(Internalin F，InlF)通過與大腦內(nèi)皮細胞表面的波形蛋白(Vimentin)相互作用，從而對內(nèi)皮細胞進行粘附和內(nèi)化[30]。見表1。

表1 單增李斯特菌在不同生理屏障中內(nèi)化素與受體的種類及作用方式

2 LM在細胞內(nèi)及細胞間的傳播

LM在感染非吞噬細胞后，將通過分泌多種毒力因子如溶血素O(LLO)、磷脂酶A(PlcA)、磷脂酶B(PlcB)、LntA介導(dǎo)胞內(nèi)逃逸和胞間傳播，從而導(dǎo)致細胞損傷[31]。研究表明，LLO可介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、改變?nèi)苊阁w的通透性、影響線粒體的正常形態(tài)，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的釋放及細胞膜的成孔反應(yīng)，使細胞內(nèi)外Ca2+和K+濃度失調(diào)，胞內(nèi)Ca2+濃度升高，胞外K+濃度升高，進而影響細胞的正常生理功能，而PlcA與PlcB 則會與LLO進行協(xié)同作用[32-33]。Li TL等[34]研究發(fā)現(xiàn)，LLO可進一步誘導(dǎo)線粒體上的mtCa2+轉(zhuǎn)運體(mtCa2+uniporter，MCU)通道過度開放，加速對Ca2+的攝取。同時線粒體中的高鈣環(huán)境將提高丙酮酸脫氫酶(PDH)的活性，而PDH是乙酰輔酶A(CoA)生成的關(guān)鍵酶，從而提高了CoA的生成量。過量形成的CoA將使Rubicon蛋白乙酰化，Rubicon是LC3相關(guān)吞噬作用(LC3-associated phagocytosis，LAP)的重要蛋白，LAP是宿主細胞吞噬和降解病原體的過程[35]。所以，被乙酰化的Rubicon蛋白將顯著影響LAP過程，從而使LM躲避殺滅，實現(xiàn)胞內(nèi)生存和擴散[36]。此外，Zhang YF等[37]研究發(fā)現(xiàn)在LM胞內(nèi)逃逸的過程中，線粒體通過產(chǎn)生超氧化物、過氧化氫以及釋放含有活性氧(ROS)的囊泡，抑制其繁殖并殺滅細菌。但抑制線粒體自噬，ROS的生成顯著增加，反之則明顯減少。另有研究表明，LLO通過介導(dǎo)線粒體自噬受體NLRX1寡聚化，使NLRX1中含有的LC3相互作用區(qū)域(LC3-Interacting region，LIR)與LC3結(jié)合，誘導(dǎo)線粒體自噬，從而消除線粒體產(chǎn)生的殺菌物質(zhì)對其生存的影響[38]。見圖2。

圖2 LLO與線粒體的相互作用

此外，LntA通過與核內(nèi)蛋白BAHD1(Bromo adjacent homology domain-containing 1 protein , BAHD1)的相互作用，使調(diào)控炎癥因子與干擾素分泌的ISGs基因被抑制，從而影響細胞對LM的免疫反應(yīng)，介導(dǎo)免疫逃逸[39]。LM在胞質(zhì)運動的過程中，肌動組裝蛋白(ActA)與肌動蛋白核化復(fù)合體2/3(Actin nucleated complex 2/3, ARP2/3)共同作用，ARP2/3復(fù)合物由7個亞基組成：ARP2、ARP3和ARPC1-5，它們共同介導(dǎo)肌動蛋白的成核和分支，與ActA一同促進肌動蛋白的聚合[40]。肌動蛋白聚合并產(chǎn)生足夠的動力在胞質(zhì)中穿梭，最后在InlC的協(xié)助下實現(xiàn)細胞間的傳播[41]。InlC是LM產(chǎn)生的一種分泌蛋白，屬于細菌內(nèi)化素蛋白家族成員之一，其表達受到毒力調(diào)節(jié)蛋白(Virulence regulatory protein)的調(diào)控，在內(nèi)化后的宿主細胞內(nèi)高度表達。同時，InlC在宿主細胞中具有多種功能，包括對細胞免疫反應(yīng)的刺激、誘發(fā)炎癥因子的產(chǎn)生[42]。InlC通過改變極化上皮細胞的頂端連接形態(tài)來調(diào)節(jié)突起的形成，在正常生理過程中，胞間極化上皮細胞頂端張力的形成需要依靠哺乳動物適配器蛋白(Tuba)和肌動蛋白調(diào)控蛋白(N-WASP2)的結(jié)合，該結(jié)合過程發(fā)生在Tuba羧基端SH36結(jié)構(gòu)域，形成的張力效應(yīng)會抑制細菌的穿胞過程[43-44]。而InlC則可能通過削弱N-WASP2的活性，或通過與N-WASP2競爭性結(jié)合Tuba，降低N-WASP2與Tuba的結(jié)合效率，從而增強LM在胞間形成突起的能力[45]。同時InlC與Tuba的結(jié)合將會使原本繃緊的頂端連接變的舒展，易形成突起，利于胞間傳播。而在感染缺乏極化能力的細胞系時，可能僅依靠ActA聚合肌動蛋白產(chǎn)生的推動力介導(dǎo)質(zhì)膜突起的形成，該過程中是否依賴InlC的介導(dǎo)存在爭議[46]。LM感染的大部分組織細胞具有極化能力，極化細胞能使組織形成致密的屏障并產(chǎn)生上皮張力，而張力作用可能誘導(dǎo)InlC響應(yīng)機制被觸發(fā)。見圖3。

圖3 LM在細胞內(nèi)逃逸及細胞間傳播的主要作用機制

3 展 望

雖然近年來在探究LM對不同生理屏障的侵襲機制方面已取得了很大進展，但仍有一些重要問題有待探索。例如：LLO引起的胞質(zhì)Ca2+濃度變化如何影響InlP的功能？LLO的成孔效應(yīng)使胞內(nèi)外Ca2+濃度失衡，胞內(nèi)高Ca2+如何影響InlP功能？這些都需要進一步確定。而通過鑒定Ca2+與InlP作用形成復(fù)合物的分子結(jié)構(gòu)有望揭示其作用機制。InlF與大腦內(nèi)皮細胞表面波形蛋白作用引起的胞內(nèi)反應(yīng)也有待闡明，這將有助于理解LM對BBB和胎盤屏障侵襲的細胞作用特點。

在胞內(nèi)過程中，LntA通過與BAHD1相互作用來抑制ISGs基因的功能，進而降低機體對LM的免疫水平，協(xié)助免疫逃逸。盡管ISGs基因的部分功能已被發(fā)現(xiàn)，但是LntA誘導(dǎo)BAHD1對ISGs抑制作用的分子機制尚不清晰。同時上皮細胞張力與InlC之間的響應(yīng)機制也有待研究，包括InlC在穿胞過程中是否參與了細胞骨架的調(diào)控。以上問題的解決對于全面理解LM的侵襲機制及胞內(nèi)作用具有重要意義。

總之，LM通過細胞受體介導(dǎo)入胞及胞內(nèi)作用是其致病性的關(guān)鍵原因，未來在該方向上利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法的相互配合，有望進一步理解和補充LM致病性的內(nèi)在機制。

利益沖突：無

引用本文格式：高凡，鄭文亞，劉犇，等.單增李斯特菌穿越生理屏障機制的研究進展[J].中國人獸共患病學(xué)報，2022，38(1)：55-61.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.173