北京及周邊地區(qū)7個地理種群的亞洲小車蝗mtDNA COI基因序列分析

李云龍， 李 霞， 梁鐵雙， 張立國， 李冬冬

（1.北京市植物保護站，北京 100029；2.安達市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，安達 151400；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，哈爾濱 156104；4.饒河出入境檢驗檢疫局，饒河 155700）

亞洲小車蝗（OedaleusasiaticusB.－Bienko）屬直翅目（Orthoptera）蝗總科（Acridoidea）絲角蝗科（Oedipodidae）小車蝗屬（Oedaleus），主要分布于河北、內(nèi)蒙古、甘肅和青海省等地，是我國北方草原的主要優(yōu)勢種害蟲，也是農(nóng)牧交錯地帶的重要經(jīng)濟害蟲［1］。亞洲小車蝗具有遠距離遷移的特性，遷移時間主要集中在晚上20：00至凌晨03：00期間，同時由于其具有較強的趨光性，因而在城市中燈光強烈的地方則吸引大量的亞洲小車蝗成蟲［2］。2000年和2002年的7月上旬至8月上旬，北京市區(qū)及區(qū)縣城區(qū)夜間燈下突然出現(xiàn)大量亞洲小車蝗成蟲，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴重損失的同時，還給市民正常生活帶來極大不便，造成了一定程度的社會恐慌。利用現(xiàn)代技術(shù)手段開展種群遺傳關(guān)系及遷移來源研究，對于做到蟲源地早監(jiān)測、早預(yù)警、早防治，降低蟲源地害蟲基數(shù)，提高監(jiān)測預(yù)警水平，提高防控工作的主動性、及時性和有效性，具有重要意義。

線粒體DNA序列分析（mtDNA sequence analysis）技術(shù)是目前進行昆蟲種群遺傳研究中最常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一。mtDNA中常用的序列分析目的基因主要有12S RNA、16S RNA、COI、COII、ND1、ND 6和Cytb基因等，其中細胞色素氧化酶I基因（COI基因）已被成功用于橘小實蠅等遷飛性昆蟲的種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究［3－6］。高書晶等也利用COI基因?qū)?nèi)蒙古地區(qū)7個不同地理種群的亞洲小車蝗樣本進行了遺傳多樣性和種群關(guān)系初步分析［7］。

本研究在收集不同地理種群亞洲小車蝗成蟲樣品的基礎(chǔ)上，采用mt DNA COI基因序列分析技術(shù)，研究北京及周邊地區(qū)亞洲小車蝗的種群遺傳關(guān)系，為進一步確定北京地區(qū)亞洲小車蝗的遷移來源，做到蟲源地提早防治提供分子生物學(xué)方面的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試亞洲小車蝗樣本包括內(nèi)蒙古自治區(qū)的錫林郭勒盟、赤峰市、烏蘭察布市，河北省的張家口市、承德市和北京的密云縣共3個省（直轄市）、6個盟市縣在內(nèi)的共7個地理種群的139個樣本（表1和圖1），所有樣本均在2011年人工采集，采集的新鮮樣品置于無水乙醇中，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 用于mtDNA研究的亞洲小車蝗樣本Table 1 Specimens of Oedaleus asiaticus for mt DNA analysis

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取與測序

采用天根生化科技（北京）有限公司的“血液／細胞／組織基因組DNA提取試劑盒”進行亞洲小車蝗總DNA的提取，并采用水平瓊脂糖凝膠電泳檢測的方法對所提取的DNA質(zhì)量進行檢測。目的片段擴增所用特異引物為“Uea7O.a”（5′－TCTCAACAAATCATAAGGACATTGG－3′）和 “Uea10O.a”（5′－TATACTTCTGGGTGTCCAAAGAATCA－3′）［8］。

PCR擴增體系為50μL，包括滅菌雙蒸水30.5μL；10× Buffer 8 μL；d NTP（25 mmol／L）3 μL；20μmol／L引物各2μL，模板 DNA（20～50 ng）3μL；TaqPlus DNA聚合酶（2 U／μL）1.5μL。擴增條件共35個循環(huán)，包括94℃預(yù)變性3 min，94℃變性1 min，57.5℃ 退火1 min，72℃ 延伸1 min；最后72℃延伸30 min，4℃保存?zhèn)溆?。PCR粗產(chǎn)物的純化和測序，委托北京奧科生物技術(shù)公司在ABI－3730測序儀上完成，所有序列采用雙向測序以確保測序的準確性。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析

序列的比對和剪切利用Clustal X（Version 1.83）軟件完成；堿基組成及單倍型分析利用 Mega version 3.1軟件［10］完成；種群遺傳分化系數(shù)（FST）、分子方差（AMOVA）分析［8］和 Mantel檢測［9］等使用 Arlequin 3.0軟件［8］完成；單倍型多樣性、核苷酸多樣性（π）、平均核苷酸差異數(shù)（k）及其相應(yīng)標準偏差（SD）等參數(shù)分析使用 DNASP 4.10.1軟件［11］完成；單倍型的統(tǒng)計簡約網(wǎng)絡(luò)（statistical parsimony）使用TCS version 1.21軟件［12］進行構(gòu)建，并根據(jù)Pfenninger和 Posada［13］提出的頻率判據(jù)（frequency criterion）、拓撲判據(jù)（topological criterion）和地理判據(jù)（geographic criterion）原則進行斷環(huán)（break the loops），以解決在統(tǒng)計簡約網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建過程中出現(xiàn)的分支、關(guān)聯(lián)等問題，在進行斷環(huán)過程中始終選擇最簡約的解決方案。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿基組成分析

在所有樣品中最終獲得準確一致的長為645 bp的線粒體DNA CO I基因部分序列139條，全部樣本序列中A、T、G和C堿基平均含量分別為34.9%、31.0%、16.1%和18.0%，A＋T 的平均含量為65.9%，明顯高于G＋C的平均含量34.1%。在645個堿基中僅檢測到12個多態(tài)性位點，占堿基總數(shù)的1.86%，其中多數(shù)變異發(fā)生在密碼子的第3位點上，占變異位點的50%，發(fā)生在第1位點的變異比例為33.3%，第2位點最少，占變異比例的16.7%。12個多態(tài)性位點中包括7個單變異多態(tài)性位點和5個簡約信息位點，在堿基的替換中，5個位點發(fā)生了轉(zhuǎn)換，6個位點發(fā)生了顛換，1個位點同時發(fā)生了轉(zhuǎn)換和顛換，所有多態(tài)性位點全部由堿基的替換產(chǎn)生，未發(fā)現(xiàn)插入和缺失。

2.2 遺傳多樣性分析

亞洲小車蝗7個地理種群的核苷酸多樣性（π）、平均核苷酸差異數(shù)（K）以及單倍型多樣性（Hd）參數(shù)值見表2。供試亞洲小車蝗樣本總體上表現(xiàn)出較低水平的核苷酸多樣性（0.000 42）和單倍型多樣性（0.205）。核苷酸多樣性最高的種群為內(nèi)蒙古赤峰廣興源種群（0.000 84），其次分別是內(nèi)蒙古烏蘭察布種群（0.000 69）、內(nèi)蒙古赤峰達萊諾日種群（0.000 41）和內(nèi)蒙古錫林郭勒種群（0.000 12），河北張家口種群、河北承德種群和北京密云種群均未發(fā)生遺傳變異，核苷酸多樣性均為0。與上述核苷酸多樣性高低排序相比，內(nèi)蒙古烏蘭察布種群的單倍型多樣性在7個種群中最高（0.338），其次分別為內(nèi)蒙古赤峰廣興源種群（0.335）、內(nèi)蒙古赤峰達萊諾日種群（0.251）和內(nèi)蒙古錫林郭勒種群（0.080）。

在139條序列中共鑒定出13種單倍型，其中共享單倍型僅4種，其余9種均為獨享單倍型。在4種共享單倍型中，單倍型H3為內(nèi)蒙古赤峰達萊諾日種群內(nèi)共享；其余3種單倍型在至少2個種群間共享，分別是H1在所有7個種群中共享，H2在內(nèi)蒙古赤峰達萊諾日種群和內(nèi)蒙古錫林郭勒種群間共享，H7在內(nèi)蒙古赤峰廣興源種群和內(nèi)蒙古烏蘭察布種群間共享。H4、H5、H6、H8、H9、H10、H11、H12、H13共9個獨享單倍型的存在，表明在各種群內(nèi)存在一定的遺傳分化（表3）。

表2 亞洲小車蝗7個地理種群樣本的遺傳分化系數(shù)F ST、基因流N m以及遺傳多樣性參數(shù)1）Table 2 Genetic differentiation coefficient（F ST），gene flow （N m）and parameters of genetic diversity in population of O.asiaticus

表3 各種群單倍型數(shù)量、頻率及在2個以上種群間共享的單倍型Table 3 The number and frequency of haplotypes in 7 populations and the haplotype shared by at least two populations

2.3 種群遺傳結(jié)構(gòu)

種群遺傳分化系數(shù)FST（F－statistic）和基因流（gene flow）是反映種群間的遺傳分化程度和各種群間基因交流情況的重要指標［14］。表2可示，各種群間遺傳分化系數(shù)（FST）在0.013 77和－0.107 01之間，差異均未達到顯著程度（P＞0.05）。FST最高值出現(xiàn)在內(nèi)蒙古赤峰達萊諾日種群與內(nèi)蒙古赤峰廣興源種群之間（0.013 77），其次是內(nèi)蒙古赤峰達萊諾日種群與內(nèi)蒙古烏蘭察布種群（0.008 93）、內(nèi)蒙古赤峰廣興源種群與內(nèi)蒙古錫林郭勒種群（0.004 37）、內(nèi)蒙古烏蘭察種群與內(nèi)蒙古錫林郭勒種群（0.003 19）；河北張家口、河北承德和北京密云3個種群間的FST值均為0，其余種群間的遺傳分化系數(shù)均為負值，表明這些種群間的遺傳分化程度均較小。

各種群間基因流在156.239 8和－265.05之間，差異也均未達到顯著程度。同為內(nèi)蒙古赤峰市的達萊諾日種群與廣興源種群之間的基因流為35.810 82，均低于內(nèi)蒙古烏蘭察種群與內(nèi)蒙古錫林郭勒種群（156.239 8）、內(nèi)蒙古赤峰廣興源種群與內(nèi)蒙古錫林郭勒種群（113.916 476）、內(nèi)蒙古赤峰達萊諾日種群與內(nèi)蒙古烏蘭察布種群（55.491 04）。其余各種群間的基因流的絕對值也都大于4，表明種群間的基因流動比較頻繁［14］。

依據(jù)各種群的地理空間特征，將供試種群劃分為6個群組：1）內(nèi)蒙古錫林郭勒；2）內(nèi)蒙古赤峰廣興源種群和內(nèi)蒙古赤峰達萊諾日種群；3）內(nèi)蒙古烏蘭察布種群；4）河北張家口種群；5）河北承德種群；6）北京密云種群。對其進行AMOVA分析，發(fā)現(xiàn)種群間變異占－6.47%，組內(nèi)種群間變異占了4.48%，種群個體間變異占了101.99%，結(jié)果表明引起種群總體變異的主要因素還是種群內(nèi)的個體間變異。

通過對地理種群FST值（表2）和Nei氏遺傳距離（Nei氏平均核苷酸差異數(shù)）與各種群間空間距離間（表4）的Mantel test結(jié)果表明，2對矩陣之間不存在顯著的相關(guān)性（R1＝－0.275 888，P1＝0.857 000；R2＝－0.014 366，P2＝0.453 000），即亞洲小車蝗種群間的遺傳分化程度與地理距離沒有顯著的相關(guān)性。

2.4 單倍型網(wǎng)絡(luò)分析

研究鑒定出的13個單倍型中，核心單倍型H1被所有7個種群的124個個體所共享，占樣本總量的89.2%。內(nèi)蒙古錫林郭勒（A）種群與內(nèi)蒙古赤峰達萊諾日（C）共享H2；內(nèi)蒙古赤峰廣興源（B）種群共鑒定出7個單倍型，分別獨享H5、H6、H7、H8、H9和H10共6個單倍型，其中單倍型H9由核心單倍型H1經(jīng)過3次突變形成，并且前兩次的中間單倍型缺失；H8由H1經(jīng)過1次突變形成單倍型H5，再由其經(jīng)過1次突變形成；內(nèi)蒙古赤峰達萊諾日（C）種群獨享H3、H4，并與A共享H2；內(nèi)蒙古烏蘭察布（D）種群分別獨享H11、H12和H13；河北張家口（E）、河北承德（F）和北京密云（G）種群29個樣本的序列全部相同，僅鑒定出一種單倍型。整體上，各單倍型之間未形成與其地理種群空間位置相對應(yīng)的聚類單元，與上述各地理種群FST值、Nei氏遺傳距離與各種群間空間距離間的Mantel test結(jié)果一致。同時，在單倍型網(wǎng)絡(luò)進化圖中也未發(fā)現(xiàn)各單倍型之間存在明顯的進化關(guān)系，僅在內(nèi)蒙古赤峰廣興源（B）種群中分別存在一定的變異分化，該種群的遺傳變異程度相對較高。

表4 7個地理種群間的Nei氏遺傳距離和地理距離1）Table 4 Nei’s genetic distances and geographic distances between 7 populations of O.asiaticus

圖1 單倍型最大簡約網(wǎng)絡(luò)進化圖Fig.1 Network showing the most parsimonious evolutionary relationships among haplotypes

3 討論

亞洲小車蝗mt DNA COI基因序列全長為1 541 bp［15］，本研究用于分析的645 bp序列位于第47位堿基至第704位堿基之間，僅檢測到12個多態(tài)性位點，占所測核苷酸的1.86%，樣本總體核苷酸多樣性僅為0.000 42。而高書晶等2011年所用473 bp序列位于第250位堿基至第723位堿基之間，共檢測到29個核苷酸變異位點，占所測核苷酸的6.13%；在截取第250位堿基至第704位堿基之后，在454個堿基中仍鑒定出27個核苷酸變異位點，占所測核苷酸的5.95%。本研究所用樣本，除內(nèi)蒙古地區(qū)的4個種群外，還有河北省和北京市的3個種群，而且所用分析序列，較高書晶等2011年截取后454 bp序列多出203 bp，但本研究樣本的多態(tài)性位點檢出率僅為1.86%，遠低于后者的5.95%，這可能是由于本研究中的實驗樣本均由同一年采集，并且亞洲小車蝗具備較強的飛翔能力，致使各種群之間存在著廣泛的基因交流和融合造成的。

在本研究中，出現(xiàn)單倍型數(shù)量最多的種群是內(nèi)蒙古赤峰廣興源種群，共檢測出7種單倍型，這可能與該種群的樣品數(shù)量最多有關(guān)；但同時，該種群的核苷酸多樣性為0.000 84，也是所有種群中核苷酸多樣性最高的種群。核苷酸多樣性是由每個群體內(nèi)各個單元型的兩兩配對差異的平均值得出，不依賴于樣本大小和序列長度，是進行遺傳座位或群體間遺傳變異程度比較的理想指標。赤峰市的克什克騰旗是內(nèi)蒙古草原地區(qū)亞洲小車蝗的主要分布區(qū)之一。在內(nèi)蒙古赤峰廣興源地區(qū)的西北方向，分布著達里諾爾湖、崗更諾爾湖以及其他的一些面積較小的湖泊和濕地，這些水源地周邊植被豐富，溫濕度適宜，為亞洲小車蝗提供了較為充足的食物和生長發(fā)育條件。內(nèi)蒙古赤峰廣興源種群遺傳多樣性較高，可能與該地區(qū)生長條件適宜，種群數(shù)量較大有關(guān)。

在本研究139個樣本中，僅鑒定出13個單倍型，單倍型檢出率為9.35%，樣本總體單倍型多樣性僅為0.205，各單倍型之間未形成與其地理種群空間位置相對應(yīng)的聚類單元；同時，在單倍型網(wǎng)絡(luò)進化圖中也未發(fā)現(xiàn)各單倍型之間存在明顯的進化關(guān)系。高書晶等2011年的研究結(jié)果也表明，亞洲小車蝗mtDNA COI序列不同單倍型之間有一定的分歧，形成不同的簇類關(guān)系，但總體上看，這種簇類關(guān)系基本上呈平行分布，沒有明顯的地域性差別。兩次結(jié)果表明，mt DNA COI基因雖然成功用于橘小實蠅等遷飛性昆蟲的種群遺傳結(jié)構(gòu)研究，但在亞洲小車蝗種類種群遺傳關(guān)系的研究中表現(xiàn)卻不理想，表明同一種目的基因的進化速率，在不同物種間存在著較大的差異。關(guān)于不同地區(qū)間亞洲小車蝗的遷移規(guī)律研究，還有待于選擇進化速率更快的遺傳標記來進行進一步研究，并適當擴大研究種群的樣本數(shù)量。

［1］鄭哲民，夏凱齡.中國動物志：昆蟲綱：第十卷：直翅目：蝗總科［M］.北京：科學(xué)出版社，2002：121－123.

［2］蔣湘，買買提明，張龍.夜間遷飛的亞洲小車蝗［J］.草地學(xué)報，2003，11（1）：75－77.

［3］Li Y，Wu Y，Chen H，et al.Population structure and colonization ofBactroceradorsalis（Diptera：Tephritidae）in China，inferred from mtDNA COI sequence［J］.Journal of Applied Entomology，2011，136（3）：1－11.

［4］吳廣超，李云龍，李志紅，等.基于線粒體COI基因的上海地區(qū)橘小實蠅種群遺傳關(guān)系研究［J］.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，17（2）：94－101.

［5］施偉，葉輝.云南桔小實蠅（Bactroceradorsalis）季節(jié)性分布區(qū)4個地理種群遺傳結(jié)構(gòu)［J］.生態(tài)學(xué)報，2007，27（6）：2477－2482.

［6］施偉，葉輝.云南桔小實蠅五個地理種群的遺傳分化研究［J］.昆蟲學(xué)報，2004，47（3）：384－388.

［7］高書晶，李東偉，劉愛萍，等.不同地理種群的亞洲小車蝗mt DNA COI基因序列及其相互關(guān)系［J］.草地學(xué)報，2011，19（5）：846－851.

［8］Zhang D X，Hewitt G M.Assessment of the universality and utility of a set of conserved mitochondrial COI primers in insects［J］.Insect Molecular Biology，1997，6（2）：143－150.

［9］Excoffier L，Laval G，Schneider S.Arlequin ver.3.0：An integrated software package for population genetics data analysis［J］.Evolutionary Bioinformatics Online，2005，1：47－50.

［10］Legendre P，Legendre L.Numerical ecology［M］.Amsterdam：Elsevier，1998.

［11］Kumar S，Tamura K，Nei M.MEGA3：integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment［J］.Briefings in Bioinformatics，2004，5（2）：150－163.

［12］Rozas J，Sánchez－DelBarrio J C，Messeguer X，et al.DnaSP，DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods［J］.Bioinformatics，2003，19（18）：2496－2497.

［13］Clement M，Posada D，Crandall K A.TCS：a computer program to estimate gene genealogies［J］.Molecular Ecology，2000，9（10）：1657－1659.

［14］Allendorf F W.Isolation，gene flow and genetic differentiation among populations［R］.Genetics and Conservation，1983：51－65.

［15］Ma C，Liu C X，Yang P C，et al.The complete mitochondrial genomes of two band－winged grasshoppers，Gastrimargus marmoratusandOedaleusasiaticus［J］.BMC Genomics，2009，10：156.