豬場(chǎng)疫病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)的應(yīng)用分析與建議：病原檢測(cè)

朱秀高

（武漢回盛生物科技有限公司，湖北武漢430042）

近年來(lái)隨著人們養(yǎng)豬規(guī)模的擴(kuò)大及國(guó)外引種數(shù)量的增長(zhǎng)，人們發(fā)現(xiàn)雖然我們的養(yǎng)殖硬件設(shè)施在不斷提高、養(yǎng)豬人員的經(jīng)驗(yàn)和學(xué)歷水平在不斷增加，但還是有一些新的疾病持續(xù)出現(xiàn)，如高致病性藍(lán)耳病、圓環(huán)病毒病，也有一些原來(lái)僅存在于課本中的疾病開(kāi)始出現(xiàn)于我們的豬群中，并造成嚴(yán)重危害，如副豬嗜血桿菌病、傳染性萎縮性鼻炎和回腸炎，同時(shí)多種疾病導(dǎo)致的混合感染已經(jīng)成為當(dāng)前豬場(chǎng)中所面臨的主要威脅，如高熱病、仔豬原因不明性腹瀉和呼吸道疾病綜合征等。

眾所周知，在應(yīng)對(duì)疾病時(shí)，特別是當(dāng)豬群發(fā)生疾病時(shí)，正確的診斷應(yīng)當(dāng)是采取進(jìn)一步措施的必要前提。在國(guó)內(nèi)80年代之前的養(yǎng)殖環(huán)境中，有經(jīng)驗(yàn)的獸醫(yī)單憑對(duì)某幾個(gè)特殊臨床癥狀的觀察就能確診豬只所發(fā)疾病，并采取相應(yīng)有效的治療措施，但隨著近年來(lái)混合感染的出現(xiàn)，單憑臨床觀察，甚至配合病理剖檢都不能再100%確診豬只所患疾病種類(lèi)，因此為了提高診斷的準(zhǔn)確性，為治療和預(yù)防措施的制定與實(shí)施提供參考，一些有條件豬場(chǎng)開(kāi)始采取與科研單位合作或自己建立實(shí)驗(yàn)室的方式，進(jìn)行疾病的實(shí)驗(yàn)室診斷，但我們?cè)谂c豬場(chǎng)交流過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，由于實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)方式的專業(yè)性要求較高，因此除了一些超大規(guī)?；i場(chǎng)外，很多豬場(chǎng)在面對(duì)如何進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，特別是在如何解讀檢驗(yàn)報(bào)告方面，欠缺很大，甚至由此造成很多不必要的誤會(huì)和對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)的不信任。為了使大家能夠?qū)?shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)所用方法有一個(gè)清晰的認(rèn)識(shí)，特別是能夠?qū)W會(huì)如何正確的閱讀與分析檢驗(yàn)報(bào)告，本文主要集中于病原檢測(cè)即針對(duì)病原檢驗(yàn)所用方法的討論與分析。

病原，顧名思義即導(dǎo)致發(fā)病的原因，針對(duì)于傳染病來(lái)說(shuō)主要是指細(xì)菌、病毒等各類(lèi)微生物，從檢測(cè)的項(xiàng)目來(lái)分，目前實(shí)驗(yàn)室中針對(duì)微生物檢驗(yàn)所用的方法可以劃分為直接法和間接法兩種，其中直接法中含有專門(mén)針對(duì)細(xì)菌的培養(yǎng)法和針對(duì)各類(lèi)病原的PCR法，間接法主要是指野毒抗體檢測(cè)法。

1 直接法

直接法是指通過(guò)直接對(duì)微生物本體或其某一組分的檢驗(yàn)，來(lái)達(dá)到測(cè)定樣品中某一特定微生物的有無(wú)及其含量的一類(lèi)方法。

1.1 培養(yǎng)法

嚴(yán)格來(lái)說(shuō)培養(yǎng)法中包含對(duì)細(xì)菌和病毒兩類(lèi)病原體的培養(yǎng)，但一般豬場(chǎng)所能用到的培養(yǎng)僅有針對(duì)細(xì)菌的培養(yǎng)，因此本敘述中，以細(xì)菌培養(yǎng)為主要對(duì)象進(jìn)行討論。

臨床上一個(gè)較為完備的細(xì)菌培養(yǎng)流程，需要配備以下幾種簡(jiǎn)單設(shè)備：無(wú)菌操作臺(tái)、酒精燈、接種環(huán)、培養(yǎng)箱、顯微鏡、常規(guī)染色劑及培養(yǎng)板，其中培養(yǎng)板可以購(gòu)買(mǎi)商業(yè)化培養(yǎng)皿或自己制作。

當(dāng)懷疑發(fā)病豬只存在細(xì)菌感染時(shí)，需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)初步判斷培養(yǎng)所需的特殊培養(yǎng)皿或通用培養(yǎng)皿，并對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行準(zhǔn)備。將病料組織接種于培養(yǎng)皿時(shí)，最好進(jìn)行無(wú)菌操作，接種后的平皿應(yīng)詳細(xì)編號(hào)記錄，并在培養(yǎng)過(guò)程中定期做好觀察，一般培養(yǎng)24小時(shí)（特殊細(xì)菌除外）即可見(jiàn)到有明顯的菌落長(zhǎng)出，接下來(lái)的工作就是要通過(guò)對(duì)菌落形態(tài)和細(xì)菌染色后的鏡檢，判斷感染細(xì)菌的種類(lèi)，如果有條件還可以進(jìn)行如生化鑒定、攻毒實(shí)驗(yàn)等方法來(lái)確定。

采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行細(xì)菌鑒定時(shí)，經(jīng)驗(yàn)是實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虺晒皽?zhǔn)確與否的關(guān)鍵因素，因?yàn)檫@一流程中的很多環(huán)節(jié)需要通過(guò)人的主觀意識(shí)來(lái)進(jìn)行評(píng)判，如細(xì)菌的生長(zhǎng)情況、菌落的特征、染色的操作和顯微鏡的檢查等。為了進(jìn)一步提高細(xì)菌培養(yǎng)檢查的準(zhǔn)確性與客觀性，同時(shí)提高操作的簡(jiǎn)單性，目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了一些細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，這些系統(tǒng)主要是通過(guò)對(duì)細(xì)菌在培養(yǎng)過(guò)程中所表現(xiàn)出來(lái)各項(xiàng)特性的評(píng)分，來(lái)達(dá)到最終確認(rèn)該細(xì)菌屬于哪種類(lèi)別的目的。從應(yīng)用來(lái)看，此類(lèi)系統(tǒng)的準(zhǔn)確性較高，且操作簡(jiǎn)單。建議豬場(chǎng)如果有條件，在建立自己的實(shí)驗(yàn)室時(shí)，還是應(yīng)以購(gòu)入此類(lèi)系統(tǒng)為主。

1.2 PCR法

PCR法是分子生物學(xué)方法的一種，也是微生物分子生物學(xué)分析流程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其理論依據(jù)是微生物分子核酸序列的專一性和特異性，根據(jù)測(cè)定對(duì)象及過(guò)程的區(qū)別可以分為普通PCR方法（針對(duì)DNA）和RT-PCR方法（針對(duì)RNA）兩類(lèi)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)細(xì)菌、病毒、支原體等各類(lèi)微生物性病原的檢測(cè)。該方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但如果要進(jìn)行結(jié)果解讀及問(wèn)題分析則需要較深的理論知識(shí)。

臨床上該方法的應(yīng)用，所需設(shè)備及試劑價(jià)格高昂，且對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)人員要求較高。一般來(lái)說(shuō)所需設(shè)備主要有PCR儀、電泳儀、紫外儀、超凈臺(tái)、冷凍離心機(jī)等，另外還需要建立專用的操作間，以防樣品交叉污染和對(duì)人體產(chǎn)生損害。試劑方面，由于自配試劑的不穩(wěn)定性，現(xiàn)在多傾向于使用商品化試劑盒，不過(guò)商品化試劑盒的批間差異性和品牌差異性，也給該方法的應(yīng)用及結(jié)果間的比較帶來(lái)困難。人員方面，一般認(rèn)為該方法能夠?qū)崿F(xiàn)流程化操作，所需人員只需能熟練操作即可，其實(shí)不然，由于該方法環(huán)節(jié)眾多，且易出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性等情況，如果操作人員沒(méi)有一定的分子生物學(xué)背景，則很難對(duì)這些情況的出現(xiàn)給出合理解釋，并提出解決方案。所以如果豬場(chǎng)想要建立自己的PCR診斷實(shí)驗(yàn)室，個(gè)人認(rèn)為，首先就是要做好選人工作，其次才是各類(lèi)設(shè)備的采購(gòu)與制度建設(shè)。

2 間接法

間接法即測(cè)定的核心目的是檢查病原的有無(wú)，但由于沒(méi)有合適的直接法或直接法操作復(fù)雜，因此通過(guò)測(cè)定其他能夠反映病原的項(xiàng)目來(lái)判斷病原是否存在。最常見(jiàn)的間接法測(cè)定病原是各類(lèi)野毒抗體檢測(cè)法，即通過(guò)對(duì)體內(nèi)野毒抗體的測(cè)定來(lái)判斷動(dòng)物機(jī)體是否存在野毒病原感染。如偽狂犬gE-ELISA抗體測(cè)定法和藍(lán)耳病野毒抗體測(cè)定法。

采用此類(lèi)方法的關(guān)鍵是要有合適的基因缺失疫苗與相應(yīng)的基因抗體檢測(cè)試劑盒，兩者缺一不可，目前僅有偽狂犬病、藍(lán)耳病及豬瘟（國(guó)內(nèi)沒(méi)有）能夠?qū)崿F(xiàn)用該方法檢測(cè)。由于每種試劑盒的檢測(cè)項(xiàng)目判斷標(biāo)準(zhǔn)不一，所以豬場(chǎng)在自己應(yīng)用測(cè)定時(shí)，應(yīng)于實(shí)驗(yàn)前仔細(xì)閱讀其說(shuō)明，并嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)要求操作與計(jì)算，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

前已述及，基于病原檢測(cè)的準(zhǔn)確性診斷是采取進(jìn)一步措施治療豬病的前提。豬場(chǎng)不管是與科研院所合作進(jìn)行代檢，還是建立自己的專有實(shí)驗(yàn)室，其中關(guān)鍵性的一環(huán)就是要選擇合適的方法，同時(shí)要對(duì)該方法有較為全面的了解，特別是對(duì)于自建實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，應(yīng)以準(zhǔn)確、操作方便、實(shí)用為主要考慮，而沒(méi)有必要一味的追求高精尖。