依維莫司聯(lián)合順鉑對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax表達(dá)的影響

劉 瑩，朱祖安，崔 濤，孔慶兗，劉 磊，張瑞瑞

（1.徐州醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，江蘇徐州 221004；2.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇徐州 221002））

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路的過度活化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［1-2］。順鉑是當(dāng)前消化道腫瘤聯(lián)合化療中常用的藥物之一，但其藥理作用的發(fā)揮往往需要很高劑量，從而導(dǎo)致較為嚴(yán)重的胃腸道不良反應(yīng)。因此，聯(lián)合用藥成為減少順鉑不良反應(yīng)的有效手段。依維莫司（everolimus，RAD001）是mTOR特異性抑制劑雷帕霉素的衍生劑，F(xiàn)ingar等［3］將RAD001作用于成人T細(xì)胞白血?。╝dult T-cell leukemia，ATL）和人T淋巴細(xì)胞白血病病毒-1（human T-cell leukemia virus type 1，HTLV-1）白血病的T細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)其能阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Chiang等［4］研究發(fā)現(xiàn)RAD001聯(lián)合吉西他濱及紫杉醇治療非霍奇金淋巴瘤對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡有協(xié)同作用。Hayun等［5］研究顯示，雷帕霉素和姜黃素通過降低Bcl-2，升高Bax，從而提高半胱-天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific protease，Caspase）-9、Caspase-3和Caspase-7的活性，誘發(fā)慢性B細(xì)胞性白血病細(xì)胞的凋亡。本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)人胃癌SGC7901細(xì)胞，并予RAD001及順鉑處理，檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的改變，探討B(tài)cl-2／Bax在RAD001聯(lián)合順鉑促SGC7901細(xì)胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌SGC7901細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco公司；RAD001購自美國Sigma公司，用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配成1mmol／L貯備液，實(shí)驗(yàn)時(shí)用RPMI 1640稀釋為實(shí)驗(yàn)所需濃度；順鉑購自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司；鼠抗人Bcl-2（sc-130308）、Bax（sc-6236）單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司；鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺（3，3′-diaminobenzidine，DAB）顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Annexin V-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（KGA107）購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；其他試劑均為分析純級(jí)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SGC7901細(xì)胞在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基含10%胎牛血清、100U／mL青霉素和100μg／mL鏈霉素，用0.5%的胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、細(xì)胞活力大于99%的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀檢測(cè) 消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC7901細(xì)胞，制成密度為1.0×105／mL的細(xì)胞懸液，置于6孔板內(nèi)，每孔5mL。24h細(xì)胞附壁后移去上清液，無血清培養(yǎng)12h后，加入藥物干預(yù)，將細(xì)胞分為對(duì)照組，順鉑組（2.50mg／L干預(yù)），RAD001低、中、高濃度組（濃度分別為5.00、10.00、20.00nmol／L）及聯(lián)合組（順鉑1.25mg／L＋RAD001 5.00nmol／L干預(yù)），每組3個(gè)平行樣本。48h后收集細(xì)胞，采用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.3 細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白的SP免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè) 消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC7901細(xì)胞，制成密度為1.0×105／mL的細(xì)胞懸液，置于放入圓形蓋玻片的6孔板內(nèi)，每孔5mL，細(xì)胞分組同1.2.2部分，24h后按分組加藥干預(yù)，每組3個(gè)平行樣本。繼續(xù)培養(yǎng)48h，取出蓋玻片，用中性甲醛溶液固定，采用SP免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，Bcl-2和Bax蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，陽性染色為深淺不一的黃棕色顆粒。每組隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)占視野總細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.2.4 細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白的Western blot檢測(cè) 待細(xì)胞鋪滿瓶底約90%后，移去上清液，實(shí)驗(yàn)分組同1.2.2，按分組加入藥物，最終體積5mL，每組3個(gè)平行樣本。藥物作用48h后收集細(xì)胞，加入蛋白裂解液，提取蛋白后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），半干轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，加入鼠抗人Bcl-2、Bax單克隆抗體，4℃冰箱過夜孵育后，洗滌加入第二抗體，室溫孵育2h，洗滌后用顯色液顯色，以β-actin為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RAD001、順鉑對(duì)SGC7901細(xì)胞凋亡率的影響 RAD001單獨(dú)或聯(lián)合順鉑作用SGC7901細(xì)胞48h后，對(duì)照組，順鉑組，RAD001低、中、高濃度組及聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率分別為（8.04±0.48）%、（18.94±0.75）%、（10.47±1.05）%、（13.93±2.45）%、（17.20±0.65）%及（23.18±1.05）%。除RAD001低濃度組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）外，其他各組細(xì)胞凋亡率均較對(duì)照組顯著增加（P＜0.05）；隨著RAD0001濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸增加，結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡率存在RAD0001濃度依賴性（P＜0.05）；聯(lián)合組分別與RAD001中濃度組、順鉑組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 RAD001、順鉑對(duì)SGC7901細(xì)胞凋亡影響的流式細(xì)胞分析（48h）

圖2 RAD001、順鉑對(duì)SGC7901細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響（SP×400）

表1 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)RAD001、順鉑對(duì)SGC7901細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響（，n=3）

表1 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)RAD001、順鉑對(duì)SGC7901細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響（，n=3）

＊：P＜0.05，與對(duì)照組比較；＃：P＜0.05，與順鉑組、RAD001中濃度組比較。

陽性率（%）組別Bcl-2／Bax Bax Bcl-2 21.90±0.70 76.03±2.36 3.47±0.01順鉑組 35.87±1.59＊ 64.40±1.31＊ 1.48±0.46＊RAD001低濃度組 33.73±1.14＊ 56.10±0.27＊ 1.91±0.85＊RAD001中濃度組 39.73±1.33＊ 53.37±1.43＊ 1.41±0.53＊RAD001高濃度組 51.43±1.50＊ 45.33±1.97＊ 0.81±0.49＊聯(lián)合組 50.43±0.71＊＃41.47±1.32＊＃0.90±0.37對(duì)照組＊

表2 Western blot檢測(cè)RAD001、順鉑對(duì)SGC7901細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響（，n=3）

表2 Western blot檢測(cè)RAD001、順鉑對(duì)SGC7901細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響（，n=3）

＊：P＜0.05，與對(duì)照組比較。

組別0.35±0.01 1.32±0.07順鉑組 0.59±0.02＊ 0.68±0.01＊RAD001低濃度組 0.47±0.01＊ 0.84±0.03＊RAD001中濃度組 0.58±0.02＊ 0.74±0.01＊RAD001高濃度組 0.67±0.01＊ 0.64±0.03＊聯(lián)合組 0.68±0.03＊ 0.61±0.03 Bax Bcl-2對(duì)照組＊

2.2 RAD001、順鉑對(duì)SGC7901細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示，SGC7901細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，陽性染色為棕黃色顆粒，見圖2。作用48h后，與對(duì)照組比較，RAD001組、順鉑組及聯(lián)合組SGC7901細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)下降，而Bax蛋白表達(dá)增加，Bcl-2／Bax比值降低（P＜0.05），見表1；聯(lián)合組分別與RAD001中濃度組、順鉑組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Western blot檢測(cè)顯示，與對(duì)照組比較，RAD001單獨(dú)或聯(lián)合順鉑作用48h后，SGC7901細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)下降，Bax蛋白表達(dá)增加（P＜0.05），其中以聯(lián)合組改變最明顯，見圖3、表2。

圖3 Western blot檢測(cè)RAD001、順鉑對(duì)SGC7901細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

mTOR是一種進(jìn)化十分保守的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，其主要控制與細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖密切相關(guān)蛋白質(zhì)的合成［6］，目前發(fā)現(xiàn)mTOR與惡性腫瘤生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡等密切相關(guān)［7-8］。雷帕霉素可與細(xì)胞內(nèi)受體FK506結(jié)合蛋白12（FK506-binding protein，F(xiàn)KBP12）結(jié)合形成 FKBP-雷帕霉素復(fù)合物，再與mTOR的FRB激酶結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，從而抑制mTOR的激酶活性［9］。過去對(duì)于RAD001的研究國內(nèi)局限于其作為免疫抑制劑在移植方面的應(yīng)用，近年在腫瘤方面的研究不斷增多［10-12］。

研究表明，mTOR在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中呈現(xiàn)過表達(dá)［13-14］，mTOR陽性患者較 mTOR陰性患者預(yù)后差［15-16］。本實(shí)驗(yàn)中利用mTOR特異性抑制劑RAD001干預(yù)胃癌SGC7901細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高濃度RAD001可以促進(jìn)SGC7901細(xì)胞凋亡；聯(lián)合用藥作用更為顯著。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)mTOR在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。

作者前期研究發(fā)現(xiàn)RAD001可通過下調(diào)Survivin蛋白表達(dá)而促進(jìn)SGC7901細(xì)胞的凋亡，從而抑制胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖［17］。從凋亡發(fā)生的機(jī)制來看，Survivin和Bcl-2分別通過不同通路行使不同的抗凋亡功能。在凋亡過程中有多種蛋白參與調(diào)控，除Survivin外，Bcl-2蛋白家族是人們研究最多的一類凋亡蛋白。Bcl-2家族成員分為兩大類：促凋亡類，如Bid、Bax、Bak等；抑凋亡類，如Bcl-2、Bcl-x1等，這2類蛋白可通過形成異二聚體發(fā)揮相互拮抗或放大作用［18-19］。因此，Bcl-2／Bax的比值是決定細(xì)胞凋亡與否的主要因素。從作用機(jī)制而言，Bcl-2不僅可能通過抑制細(xì)胞色素C從線粒體的釋放而調(diào)控線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔的開啟，從而抑制Caspase-3的活化，還可能參與抑制Caspase-3的合成［20-21］。

為了進(jìn)一步探討RAD001的促細(xì)胞凋亡機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)中采用SP免疫細(xì)胞化學(xué)及Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示RAD001單獨(dú)及聯(lián)合順鉑可誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞凋亡，聯(lián)合作用強(qiáng)于單獨(dú)用藥。RAD001單獨(dú)作用SGC7901細(xì)胞可下調(diào)Bcl-2，上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，Bcl-2／Bax比值下降；RAD001聯(lián)合順鉑作用后這種作用增強(qiáng)。因此，作者認(rèn)為RAD001聯(lián)合順鉑可通過上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞凋亡。但本實(shí)驗(yàn)僅為體外實(shí)驗(yàn)，下一步作者將會(huì)應(yīng)用RAD001聯(lián)合順鉑作用于裸鼠異種移植性胃癌模型，進(jìn)行哺乳動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以揭示RAD001在胃癌治療上的潛在應(yīng)用價(jià)值，為其今后臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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