KLF4對人胃癌細胞株SGC-7901體外增殖及遷移侵襲能力的影響＊

黃 鎮(zhèn)，王子衛(wèi)△，張 能，查 郎，吳 釗

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科，重慶 400016；2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川成都 610041）

腫瘤是世界范圍內(nèi)嚴重的公共衛(wèi)生問題，在美國，每年有1／4的死亡由惡性腫瘤所致［1］，而作為最常見的上皮源性惡性腫瘤和主要的腫瘤致死性相關(guān)疾病，全球每年有12%的腫瘤患者死于胃癌［2］。雖然手術(shù)切除是胃癌治療的首選方案之一，特別是早中期胃癌［3］，然而，由于腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移，治療常常十分棘手。胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移涉及一系列分子水平的異常，Krüppel樣因子4（Krüppel-like factor 4，KLF4）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種細胞生長抑制因子，參與細胞增殖、分化、遷移、凋亡等多種生理、病理過程的調(diào)控［4］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中KLF4低表達，明顯低于癌旁及正常組織，并且其陽性表達與腫瘤浸潤層次和淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)［5］。本實驗選用人胃癌SGC-7901細胞株，轉(zhuǎn)染KLF4基因，進一步探討KLF4對胃癌細胞的生物學(xué)行為及功能的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株與質(zhì)粒 人胃癌SGC-7901細胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實驗研究中心備存。pcDNA3.1-IRES-EGFP真核質(zhì)粒載體購于北京泛基諾科技有限公司，pcDNA3.1IEKLF4重組真核質(zhì)粒載體由北京泛基諾科技有限公司協(xié)助構(gòu)建。

1.2 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基、G418購于美國Gibco公司，新生小牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購于美國Sigma公司，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，胰蛋白酶和脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen公司；RNAiso Plus、PrimeScript RT reagent Kit、Premix Taq購于大連TaKaRa公司，DNA marker購于北京天根生化科技有限公司；Transwell小室（8μm孔徑）和人工基質(zhì)膠Matrigel購于美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 人胃癌SGC-7901細胞株呈貼壁生長，培養(yǎng)于含10%新生小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱。倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細胞生長情況。0.1%胰蛋白酶消化、收集細胞，按1∶2～4傳代。取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.3.2 構(gòu)建真核表達載體pcDNA3.1IE-KLF4 pcDNA3.1-IRES-EGFP載體可表達綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP），并具有對新霉素（neomycin）的抗藥基因，其產(chǎn)物可將G418轉(zhuǎn)化為無毒形式。pcDNA3.1IE-KLF4重組真核載體由北京泛基諾科技有限公司協(xié)助構(gòu)建；將KLF4基因連接到上述載體的BamHⅠ／EcoRⅠ位點，對pcDNA3.1IE-KLF4最終載體行酶切和測序鑒定，證實構(gòu)建成功。

1.3.3 脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染并建立KLF4穩(wěn)定過表達細胞株將細胞分為未轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1-IRES-EGFP轉(zhuǎn)染組（即空載體組）、pcDNA3.1IE-KLF4轉(zhuǎn)染組（即轉(zhuǎn)染組）。轉(zhuǎn)染前1d，胰蛋白酶消化、收集細胞，接種于6孔板，每孔細胞2×105個，37℃、5%CO2培養(yǎng)至約60%匯合。每孔質(zhì)粒（μg）與脂質(zhì)體（μL）按1.0∶2.5配制轉(zhuǎn)染復(fù)合液，分別加入上述各組并輕輕混勻，OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基補足至2mL。6h后，更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。24h后觀察轉(zhuǎn)染情況，成功轉(zhuǎn)染的細胞表達GFP，因而可被激發(fā)出綠色熒光，使細胞在熒光倒置顯微鏡下呈現(xiàn)為綠色。48h后，根據(jù)預(yù)實驗測定的最佳濃度行G418篩選（350μg／mL）。10～14d后，挑取單個克隆，以G418維持濃度（250μg／mL）擴大培養(yǎng)以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株供后續(xù)實驗所用。

1.3.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測各實驗組KLF4mRNA的表達實驗分組同前。取各實驗組對數(shù)生長期細胞，按RNAiso Plus試劑說明書提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度儀定量RNA濃度和純度，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：37℃逆轉(zhuǎn)錄15min，85℃逆轉(zhuǎn)錄酶失活5s。擴增引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計合成，序列如下：KLF4上游引物：5′-CTT CCT GCC CGA TCA GAT GC-3′，下游引 物：5′-CGG TAG TGC CTG GTC AGT TCA-3′，產(chǎn)物大小298bp；GAPDH 上游引物：5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′，下游引物：5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′，產(chǎn)物大小476bp。擴增條件：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共循環(huán)30次。擴增產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像分析儀觀察拍照，Quantity One軟件分析圖像。

1.3.5 四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測各實驗組細胞增殖能力 胰蛋白酶法收集上述各實驗組對數(shù)生長期細胞，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為2.5×104／mL，接種于96孔板（200μL／孔），每組設(shè)8個平行復(fù)孔。分別在接種后0、24、48、72h，每孔加入 MTT溶液（5mg／mL）20μL；常規(guī)培養(yǎng)4h后，棄上清液，加入DMSO（200μL／孔），振蕩10min使結(jié)晶物充分溶解?？瞻渍{(diào)零后，酶標(biāo)儀檢測570nm波長處的吸光度（Absorbance，A）值。細胞增殖抑制率的計算公式：抑制率=（1-實驗組A570／對照組A570）×100%。

1.3.6 劃痕試驗檢測細胞遷移能力 按上述方法收集各組細胞接種于6孔板中（1×106／孔）。待細胞生長匯合成單層細胞后，用無菌的中號移液器槍頭在細胞層上小心地行“一”字形劃痕，PBS清洗2次，倒置顯微鏡下觀察劃痕處無懸浮或游離的細胞。分別在0、24、48h觀察并拍照各組劃痕愈合程度（反映細胞遷移能力），細胞遷移率的計算公式：遷移率=（1-48h劃痕距離／初始距離）×100%。

1.3.7 Transwell小室檢測細胞侵襲能力 用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠至5mg／mL，取40μL加到Transwell小室膜上，37℃孵育使其凝固，紫外燈照射消毒過夜。實驗前加入30μL無血清RPMI 1640培養(yǎng)基水化基底膜（37℃，30min）。收集各實驗組細胞，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為5×105／mL，于上室中加入此細胞懸液400μL，下室中加入含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基600μL，常規(guī)培養(yǎng)。24h后，取出小室，用棉簽小心擦去上層細胞和基質(zhì)膠，并用PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30min，蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，中性樹膠封片。每張片隨機選取5個視野進行細胞計數(shù)并拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用表示，組間比較采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染效率的測定 轉(zhuǎn)染24h后，熒光倒置顯微鏡觀察，成功轉(zhuǎn)染的細胞因表達GFP而被激發(fā)出綠色熒光，在鏡下呈現(xiàn)出綠色，見圖1。

2.2 轉(zhuǎn)染后各組細胞KLF4mRNA的表達 結(jié)果見圖2所示，在pcDNA3.1IE-KLF4轉(zhuǎn)染組中可見明顯擴增的KLF4基因片段，長度為298bp，而其他兩組中相應(yīng)位置幾乎未見相應(yīng)條帶或表達極低，因此，可以認為轉(zhuǎn)染成功，轉(zhuǎn)染組細胞中有KLF4mRNA的表達，見圖2。

2.3 MTT法測定各組細胞的生長增殖情況 MTT法檢測結(jié)果見表1。在各時間觀察點，未轉(zhuǎn)染組與空載體組細胞的A570值比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。24h時，轉(zhuǎn)染組細胞A570值較對照組降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；在48h和72h，轉(zhuǎn)染組細胞A570值明顯低于未轉(zhuǎn)染組和空載體組（P＜0.05）。以對照組作為參照，24、48、72h轉(zhuǎn)染組的細胞增殖抑制率分別為12.90%、23.85%、25.56%。

圖1 轉(zhuǎn)染24h后的SGC-7901細胞（熒光倒置顯微鏡 ×200）

2.4 劃痕試驗檢測細胞體外遷移能力 劃痕48h后，未轉(zhuǎn)染組和空載體組細胞的遷移率分別為（78.15±4.86）%、（73.75±4.03）%，二者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；轉(zhuǎn)染組細胞的遷移率為（60.84±5.56）%，較對照組下降（P＜0.05），見圖3。

2.5 Transwell小室檢測細胞體外侵襲能力 侵襲試驗結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染組和空載體組的侵襲穿膜細胞數(shù)分別為（163.53±13.95）個、（158.07±12.54）個，組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；轉(zhuǎn)染組的侵襲穿膜細胞數(shù)為（73.87±8.70）個，較對照組明顯減少（P＜0.05），見圖4。

圖2 RT-PCR檢測各組細胞KLF4mRNA的表達

表1 不同時間點KLF4mRNA對SGC-7901細胞增殖的影響（，%，n=3）

表1 不同時間點KLF4mRNA對SGC-7901細胞增殖的影響（，%，n=3）

a：P＜0.05，與未轉(zhuǎn)染組比較；b：P＜0.05，與空載體組比較。

組別0h 24h 48h 72h未轉(zhuǎn)染組 0.283 6±0.283 6 0.377 2±0.077 5 0.468 0±0.098 40.528 7±0.080 4空載體組 0.285 0±0.057 4 0.385 1±0.069 8 0.459 4±0.064 7 0.513 1±0.067 6轉(zhuǎn)染組 0.287 5±0.062 0 0.312 9±0.103 0 0.353 1±0.057 6ab 0.387 7±0.029 0ab

圖3 劃痕試驗檢測KLF4對SGC-7901細胞遷移能力的影響（倒置顯微鏡×100）

3 討 論

胃腸道是一個開放的系統(tǒng)，其黏膜上皮一方面受到機械、化學(xué)以及生物因素等的侵襲而損傷脫落；另一方面，其上皮細胞通過增殖、分化、遷移以不斷更替，因此，胃腸道上皮處于損傷和抗損傷的動態(tài)平衡中。若此過程中某因素發(fā)生改變或調(diào)節(jié)失控，則可能導(dǎo)致正常細胞惡性轉(zhuǎn)化。作為最常見的腫瘤之一，胃癌的發(fā)病機制尚不明確，其發(fā)生、發(fā)展與多種因素相關(guān)。雖然已有手術(shù)、放療、化療等多種治療手段，但其治療常常因腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移而失敗。KLF4是KLF家族中的重要成員之一，其羧基端的3個鋅指結(jié)構(gòu)，為該家族特征性結(jié)構(gòu)［6］。KLF4主要表達于胃腸道上皮、皮膚、血管內(nèi)皮和胸腺，并且主要在上皮細胞分化末期、有絲分裂后期表達［7］，因此，也稱為胃腸富集KLF或上皮鋅指蛋白。人類KLF4基因位于9q31，有5個外顯子，其cDNA全長1 440bp，編碼產(chǎn)物為含有479個氨基酸殘基的蛋白。

KLF4與多種生命活動相關(guān)，包括生長、發(fā)育、增殖、分化等。研究表明，在胚胎發(fā)育晚期及腸管分化終末期的上皮細胞中KLF4表達均增高，在生長抑制的狀態(tài)下亦明顯增高，提示KLF4可抑制某些細胞的增殖，對調(diào)節(jié)上皮細胞分化有重要作用［8］。細胞的增殖依賴于細胞周期完整、有序地進行，而KLF4作為一種細胞生長抑制因子，一方面抑制Cyclin D1、鳥氨酸脫羧酶等細胞周期正性調(diào)節(jié)基因的啟動子，下調(diào)它們的表達；另一方面，KLF4還可誘導(dǎo)P21、P27、P53等細胞周期負調(diào)控因子表達，阻滯細胞G1期向S期轉(zhuǎn)化，從而抑制細胞增殖［9-10］。Ghaleb等［11］發(fā)現(xiàn)，有條件地敲出 KLF4基因后，缺陷小鼠小腸上皮細胞的增殖和遷移得到上調(diào)，并伴有腸絨毛刷狀緣分泌因子的改變和潘氏細胞異位；而在結(jié)腸，則伴有碳酸酐酶的減少和杯狀細胞的分化與成熟障礙。研究證實KLF4與多種腫瘤密切相關(guān)，其中膀胱癌、前列腺癌、食管癌、結(jié)直腸癌、胃癌等腫瘤中KLF4表達降低，而在乳腺導(dǎo)管癌和口腔鱗癌中KLF4表達上調(diào)。Xu等［12］研究發(fā)現(xiàn)，采用DNA去甲基化制劑5-氮-2′脫氧胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-dC）處理結(jié)腸癌SW620、RKO細胞系后，KLF4表達上調(diào)，提示KLF4在結(jié)直腸腺瘤和癌中的極度低表達可能與表觀遺傳學(xué)的調(diào)控有關(guān)，啟動子區(qū)異常甲基化降低了KLF4的表達。該研究還發(fā)現(xiàn)，雖然KLF4的表達情況與結(jié)直腸癌患者的總體預(yù)后無明顯關(guān)聯(lián)，但是對于已有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者，KLF4陽性表達者的預(yù)后優(yōu)于陰性表達者。

Wnt（wingless and int-1）／β-鏈蛋白（β-catenin）信號通路與正常組織發(fā)育和多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在腫瘤演變中亦起著極為重要的作用；該通路涉及β-catenin、結(jié)腸腺瘤性息肉?。╝denomatous polyposis coli，APC）因子、T細胞因子4（T cell factor 4，TCF-4）、淋巴增強因子（lymphoid enhancer factor，LEF）等參與，β-catenin是其中最重要的因子之一［13］。KLF4可直接與β-catenin轉(zhuǎn)錄活化區(qū)結(jié)合，下調(diào)β-catenin表達，并抑制其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄［14］，提示 KLF4不僅是 Wnt／β-catenin信號通路中的重要成員，而且在此通路中發(fā)揮抑制作用。另外，KLF4還是一種干細胞相關(guān)因子，慢病毒介導(dǎo)聯(lián)合轉(zhuǎn)染八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（octamer-binding transcription factor-4，Oct-4）、性別決定區(qū)Y框蛋白2（sex determining region Y-box 2，SOX-2）、C-MYC及KLF4可誘導(dǎo)正常體細胞向多能干細胞轉(zhuǎn)化，進而發(fā)生增殖、分化、轉(zhuǎn)移的改變［15］。

侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的特性之一，亦是腫瘤惡性進展的關(guān)鍵步驟。在此過程中，腫瘤細胞無限增殖是前提，而腫瘤細胞同質(zhì)黏附降低和異質(zhì)黏附增強，使得腫瘤細胞更易脫落，并降解細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），遷移至鄰近組織，進而發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。本研究以質(zhì)粒為載體將KLF4基因成功轉(zhuǎn)入胃癌SGC-7901細胞，RT-PCR證實轉(zhuǎn)染細胞中KLF4 mRNA表達水平明顯提高。MTT顯示轉(zhuǎn)染KLF4基因后，細胞增殖下降，與此前另一研究方法結(jié)果一致［16］。劃痕試驗和Transwell小室試驗顯示轉(zhuǎn)染組細胞遷徙侵襲能力下降，其機制可能與 KLF4與β-catenin相互作用有關(guān)［14，17］，而β-catenin不僅是重要的細胞連接和黏附因子，亦是 Wnt／β-catenin信號通路中的核心成員之一。上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-tomesenchymal transition，EMT）參與了腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，沉默KLF4將會導(dǎo)致上皮細胞在形態(tài)和遷移方面發(fā)生變化，與此相伴的是上皮性鈣黏附蛋白（E-cadherin）丟失，而KLF4表達上調(diào)后能明顯恢復(fù)E-cadherin的表達，同時抑制癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［18］。本研究顯示KLF4表達上調(diào)后，胃癌細胞增殖、遷移和侵襲能力發(fā)生改變，提示KLF4可能成為胃癌分子治療的潛在靶點，至于其中的機制，特別是KLF4與β-catenin、E-cadherin之間如何相互作用，是否還有其他因子參與，將會是筆者后續(xù)研究的重點。

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