AMPK激活對(duì)大鼠心肌細(xì)胞蛋白降解的影響＊

陳保林，陳丹丹，馬躍東，熊肇軍，劉 晨，4，董吁鋼，4

（1.貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科，貴州貴陽(yáng) 550002；2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管醫(yī)學(xué)部，廣東廣州 510080；3.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院心內(nèi)科，廣東廣州 510630；4.衛(wèi)生部輔助循環(huán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510080）

單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是真核細(xì)胞生物中一個(gè)重要的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶［1］。在運(yùn)動(dòng)、缺血、缺氧等情況下，細(xì)胞內(nèi)AMP／ATP比值顯著升高時(shí)，AMPKα亞基的Thr172殘基發(fā)生磷酸化修飾后激活而具有生物活性［2］。AMPK的下游靶蛋白主要與糖、脂以及蛋白質(zhì)等能量代謝調(diào)節(jié)有關(guān)［3-4］。有研究表明AMPK在平滑肌中參與了蛋白質(zhì)降解的調(diào)控［5］，然而，AMPK是否參與心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)降解的調(diào)控，國(guó)內(nèi)、外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。

3-甲基組氨酸（3-methylhistidine，3-MH）是存在于肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白中的一類轉(zhuǎn)錄后修飾的氨基酸［6-7］。由于缺乏特異性的tRNA，肌肉蛋白質(zhì)在分解代謝時(shí)釋放的3-MH不能作為tRNA的底物參與新蛋白質(zhì)的合成，因此，3-MH被認(rèn)為是肌細(xì)胞蛋白質(zhì)降解的生物學(xué)標(biāo)志［8-9］。通過(guò)測(cè)定心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中3-MH的濃度能夠反應(yīng)心肌細(xì)胞肌纖維蛋白的降解率。本研究通過(guò)觀察AMPK激動(dòng)劑5-氨基咪唑-4-甲酰胺-1-β-D-呋喃核糖苷（5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-D-ribofuranoside，AICAR）對(duì)培養(yǎng)心肌細(xì)胞3-MH釋放率的影響，旨在探討AMPK在調(diào)控心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)分解代謝中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生1～3d的Sprague-Dawley（SD）大鼠，清潔級(jí)，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)動(dòng)物倫理委員會(huì)許可。

1.1.2 主要試劑及儀器 Dulbecco′s改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM）／F12培養(yǎng)基、胎牛血清為美國(guó)HyClone公司產(chǎn)品，Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó) Gibco公司，AICAR、兔抗大鼠p-AMPK-α（Thr172）抗體、兔抗大鼠 AMPK-α抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling（CST）公司，AMPK抑制劑Compound C為德國(guó)Merck公司產(chǎn)品，小鼠抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GADPH）抗體購(gòu)自上?？党缮锕こ逃邢薰?，小鼠抗大鼠α-actinin抗體、羊抗小鼠IgG-辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）以及羊抗兔IgG-HRP購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，免疫印跡發(fā)光試劑盒為美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品，3-MH標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，色譜純甲醇為美國(guó)TEDIA公司產(chǎn)品。主要儀器包括：顯微成像分析系統(tǒng)（日本OLYMPUS公司）、電泳系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司）、LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）、C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm，日本GL Sciences公司）等。

1.2 方法

1.2.1 原代心肌細(xì)胞培養(yǎng) 在超凈工作臺(tái)內(nèi)，無(wú)菌條件下取出乳鼠心臟，洗凈后將心室心肌組織剪碎成約1mm3大小，先后用0.05%Ⅰ型膠原酶和0.125% 胰蛋白酶消化，收集心肌細(xì)胞懸液至含10% 胎牛血清的培養(yǎng)基中，置于37℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)60min，差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞，重懸的心肌細(xì)胞以5×105／mL的密度接種于6孔板，再放入5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待培養(yǎng)后細(xì)胞生長(zhǎng)融合成片并出現(xiàn)同步收縮，換成無(wú)血清的培養(yǎng)基，饑餓24h后進(jìn)行分組干預(yù)［10-11］。

1.2.2 心肌細(xì)胞的免疫化學(xué)染色鑒定 制作心肌細(xì)胞爬片，用4%多聚甲醛固定；再以3%H2O2孵育10min；滴加非免疫動(dòng)物血清孵育10min；再滴加α-actinin第一抗體（1∶200）4℃過(guò)夜。次日加生物素標(biāo)記的第二抗體，室溫下孵育20min后滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶，10min后二氨基聯(lián)苯胺（3，3′-diaminobenzidine，DAB）顯色，鏡下觀察。

1.2.3 心肌細(xì)胞的分組及總蛋白質(zhì)的提取 為觀察AMPK特異性激動(dòng)劑AICAR和AMPK抑制劑Compound C對(duì)AMPK蛋白表達(dá)以及磷酸化活性的影響，將心肌細(xì)胞按處理方式分為：對(duì)照組（未進(jìn)行特殊處理）、AICAR組（培養(yǎng)基含AICAR 1mmol／L）、Compound C組（培養(yǎng)基含 Compound C 1μmol／L）及 AICAR＋Compound C 組（培養(yǎng)基含 AICAR 1mmol／L及Compound C 1μmol／L）。干預(yù)6h后提取總蛋白，采用Bradford法計(jì)算出樣品總蛋白濃度（μg／μL）。

1.2.4 Western blot檢測(cè) 各取50μg樣品蛋白進(jìn)行8%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），電泳結(jié)束后蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上（80V，120min），5%脫脂奶粉封閉1h，分別加入第一抗體工作液中，p-AMPK-α兔抗大鼠（1∶1 000）、AMPK-α兔抗大鼠（1∶1 000）、GADPH小鼠抗大鼠 （1∶20 000），4℃孵育過(guò)夜；次日PVDF膜再分別與HRP標(biāo)記的羊抗兔或羊抗小鼠第二抗體室溫下孵育1h；免疫印跡用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminecence，ECL）顯影、曝光，采用IPP 6.0圖像分析軟件檢測(cè)。以GAPDH作為內(nèi)參，以灰度比值表示所檢測(cè)蛋白質(zhì)的相對(duì)含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.2.5 高效液相色譜儀檢測(cè)心肌細(xì)胞3-HT釋放量 參照課題組以前介紹的方法［11］，取0.5mL心肌細(xì)胞培養(yǎng)基加入100μL乙腈萃取。取100uL上清液加入100μL衍生化試劑和1mL硼酸緩沖液中（0.4mol／L），用0.22μm的針頭過(guò)濾器過(guò)濾后立即進(jìn)樣20μL分析。用3-MH標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確配成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，將5個(gè)梯度體積的標(biāo)準(zhǔn)液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品中3-MH的峰面積帶入，計(jì)算出其含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），各組兩兩比較采用Student Newman Keul′s（SNK）檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 心肌細(xì)胞的鑒定及純度 顯微鏡下觀察，體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞展開(kāi)，80%以上融合成片，呈同步收縮。α-actinin免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，陽(yáng)性率大于99%，培養(yǎng)48h后的心肌細(xì)胞達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 AICAR對(duì)心肌細(xì)胞AMPK活性的影響 AICAR干預(yù)細(xì)胞6h后，各組心肌細(xì)胞總AMPK的表達(dá)無(wú)明顯差異，對(duì)照組、AICAR組、Compound C組及AICAR＋Compound C組心肌細(xì)胞p-AMPK／AMPK的灰度比值分別為：0.47±0.034、0.83±0.07、0.32±0.03及0.62±0.05。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，AICAR組心肌細(xì)胞p-AMPK／AMPK灰度比值增高（P＜0.05），Compound C組心肌細(xì)胞p-AMPK／AMPK灰度比值降低（P＜0.05），提示AICAR激活心肌細(xì)胞AMPK，而Compound C則抑制AMPK激活；與AICAR組與比較，Compound C＋AICAR組p-AMPK／AMPK灰度比值降低（P＜0.05），提示Compound C逆轉(zhuǎn)了AICAR對(duì)心肌細(xì)胞AMPK的激活作用。見(jiàn)圖1。

圖1 AICAR對(duì)AMPK磷酸化激活的影響

2.3 AMPK活性對(duì)心肌細(xì)胞蛋白降解的影響 以3-MH的色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X）為橫坐標(biāo)，利用不同濃度的3-MH標(biāo)準(zhǔn)品與各自對(duì)應(yīng)的峰面積建立回歸方程：Y=731 241 X＋896.86，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，在1.6μmo／L至107μmo／L的濃度范圍內(nèi)3-MH濃度與峰面積線性關(guān)系良好。本實(shí)驗(yàn)中所檢測(cè)的培養(yǎng)基中，3-MH濃度在4.8～68.3μmo／L范圍。研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，AICAR明顯促進(jìn)細(xì)胞蛋白降解（P＜0.01），Compound C能夠抑制心肌細(xì)胞蛋白降解（P＜0.01）；Compound C還逆轉(zhuǎn)了AICAR對(duì)蛋白降解的促進(jìn)作用（P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

圖2 AICAR對(duì)心肌細(xì)胞3-MH釋放量的影響

3 討 論

AMPK是由一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為63×103的α亞基，一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為43×103的β亞基以及一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為38×103的γ亞基組成的異源三聚體［1］，是能量代謝的重要調(diào)節(jié)酶，對(duì)調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)，增殖有重要作用［12］。作為機(jī)體能量調(diào)節(jié)器，AMPK能對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)AMP／ATP比例變化反應(yīng)迅速。在缺血、缺氧、葡萄糖缺乏、饑餓等情況下，心肌組織能量缺乏，AMP／ATP比例增加，繼而AMPK磷酸化激活。AMPK激活后通過(guò)調(diào)控代謝相關(guān)酶發(fā)揮能量代謝的調(diào)控作用［13-14］，如AMPK磷酸化激活乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）后增加脂肪酸的攝取和氧化；促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)移酶4加速葡萄糖的攝取，刺激糖酵解，增加ATP生成；同時(shí)為了保存細(xì)胞內(nèi)ATP水平，抑制蛋白質(zhì)以及脂質(zhì)合成，使細(xì)胞耗能活動(dòng)減弱。以上這些調(diào)節(jié)反應(yīng)使心肌細(xì)胞得以保持ATP的水平，有助于維持心肌細(xì)胞的功能。而蛋白質(zhì)降解也是能量缺乏時(shí)機(jī)體反應(yīng)的一部分，AMPK是否參與心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)降解的調(diào)控尚不清楚。本研究中，通過(guò)AMPK激動(dòng)劑AICAR和抑制劑Compound C干預(yù)離體培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，并應(yīng)用高效液相色譜法檢測(cè)心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中3-MH釋放量，發(fā)現(xiàn)AMPK激活后3-MH釋放明顯增加，而抑制AMPK活性后3-MH釋放顯著減少，以上結(jié)果提示AMPK能夠促進(jìn)3-MH釋放，參與心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)降解的調(diào)控。

與其他組織、器官一樣，心肌細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成與降解之間有序的動(dòng)態(tài)平衡受到嚴(yán)密調(diào)控。蛋白轉(zhuǎn)換同時(shí)存在于心肌細(xì)胞肥大和萎縮這兩種不同的病理過(guò)程中，只是合成與分解的相對(duì)比例不同［15］。心肌肥大和萎縮的本質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)肌纖維蛋白量增減，因此，對(duì)心肌細(xì)胞肌纖維蛋白降解的檢測(cè)將有助于尋找有效逆轉(zhuǎn)心肌肥大的藥物以及客觀評(píng)價(jià)逆轉(zhuǎn)肥大藥物的治療效果。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，作為心肌細(xì)胞能量代謝重要調(diào)節(jié)酶的AMPK不僅調(diào)控心肌細(xì)胞葡萄糖和脂肪代謝，還參與蛋白降解的調(diào)控，提示其可能是心肌細(xì)胞肥大的治療靶點(diǎn)，為今后AMPK激活逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞肥大的治療提供理論依據(jù)。然而，這需要通過(guò)構(gòu)建心肌細(xì)胞肥大模型來(lái)進(jìn)一步論證。此外，AMPK是一個(gè)蛋白激酶，并沒(méi)有水解功能，其如何調(diào)控蛋白降解也需要進(jìn)一步探討。

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