HPLC法測定三叉苦中異吳茱萸酮酚含量

李洪福，王勇，魏娜，李永輝

（海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院熱帶藥用植物研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571101）

HPLC法測定三叉苦中異吳茱萸酮酚含量

李洪福，王勇，魏娜，李永輝*

（海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院熱帶藥用植物研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571101）

目的：建立HPLC法測定三叉苦中異吳茱萸酮酚含量的方法，為三叉苦藥材的質(zhì)量控制和評價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。方法：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈－醋酸水體系洗脫，體積流量為1.0mL·min－1，柱溫30℃，檢測波長為230nm。結(jié)果：在線性范圍29.5～442.8μg，異吳茱萸酮酚對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好的線性關(guān)系，r＝0.998 8，該方法的平均回收率為103.9％，RSD＝0.90％。結(jié)論：本方法快速、簡便、重復(fù)性好，可用于三叉苦中異吳茱萸酮酚的含量測定。

三叉苦；異吳茱萸酮酚；HPLC；苯并二氫吡喃類

三叉苦Evodia lepta（Spr.）Meer.是蕓香科吳茱萸屬植物，又稱三丫苦、三椏苦、三枝槍、小黃散、雞骨樹、三叉虎，廣泛分布于我國東北至西南各地，是嶺南常用中草藥，始載于《嶺南采藥錄》，性味苦，寒，具有清熱解毒，祛風(fēng)除濕的功效［1］。對于三叉苦藥材中化學(xué)成分的研究主要集中在苯并二氫吡喃類和生物堿類化合物上［2-4］。其中在苯并二氫吡喃類化合物中，異吳茱萸酮酚分離得到的較早，其同類化合物結(jié)構(gòu)的確證也是以該化合物為基礎(chǔ)進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)溝通并依據(jù)相關(guān)波譜數(shù)據(jù)進(jìn)行的。因此，本實(shí)驗(yàn)以異吳茱萸酮酚為對照品，建立三叉苦中異吳茱萸酮酚含量的HPLC測定方法，為三叉苦藥材及其成方制劑的質(zhì)量控制和科學(xué)評價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與儀器

日本島津高效液相色譜儀（LC-6AD泵，SPD-10A檢測器，自動(dòng)進(jìn)樣），色譜柱：Kromasil C18柱（250mm×4.6mm，5μm），乙腈和甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

三叉苦藥材由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所采集提供，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院楊衛(wèi)麗老師鑒定為蕓香科植物三叉苦 Evodia lepta（Spr.）Meer.。異吳茱萸酮酚對照品由海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院植物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離制備，經(jīng)光譜分析并對照文獻(xiàn)鑒定為異吳茱萸酮酚［5］，經(jīng)DAD檢測器檢測，采用面積歸一化法計(jì)算其純度大于99％。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Kromasil C18柱（250mm×4.6mm，5μm），柱溫為30℃，檢測波長為230nm，體積流量為1.0mL·min－1，進(jìn)樣量為20μL，流動(dòng)相為乙腈-0.1％醋酸水（55∶45）。理論塔板數(shù)按異吳茱萸酮酚計(jì)算大于10 000，供試品中異吳茱萸酮酚與其他成分達(dá)到了有效分離，分離度大于1.5，對照品及供試品的色譜見圖1。

圖1 三叉苦和對照品的HPLC圖

2.2 對照品溶液的制備

精密稱定異吳茱萸酮酚對照品0.036 9g，置于25mL容量瓶中，用色譜純甲醇稀釋至刻度，得1.476mg·mL－1的對照品儲(chǔ)備液，精密吸取上述儲(chǔ)備液1.00mL置10mL容量瓶中，用色譜純甲醇稀釋至刻度，得147.6μg·mL－1的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱定1.000g三叉苦藥材粉末，共3份，置磨口三角瓶中，分別精密吸取50.00mL 50％乙醇置上述3份三叉苦藥材粉末中，稱重，水浴加熱回流提取1h，再稱重，用50％乙醇補(bǔ)足減失的重量，過濾后取續(xù)濾液即得。

2.4 線性關(guān)系考察

取對照品儲(chǔ)備液適量，配制成29.52，73.80，147.6，221.4，295.2，442.8μg·mL－1系列對照品溶液，各取20μL，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝32 017X－33 923，r＝0.998 8，表明異吳茱萸酮酚在29.5～442.8μg線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取147.6μg·mL－1異吳茱萸酮酚對照品溶液20μL重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計(jì)算得異吳茱萸酮酚峰面積的RSD＝0.94％。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱定約1.000g共6份三叉苦藥材粉末，置磨口三角瓶中，吸取50.00mL 50％乙醇，稱重，水浴加熱回流提取1h，再稱重，用50％乙醇補(bǔ)足減失的重量，過濾后取上述6份乙醇提取液的續(xù)濾液，進(jìn)樣20μL，計(jì)算得異吳茱萸酮酚峰面積的RSD＝1.06％。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱定0.500g三叉苦藥材粉末9份，置磨口三角瓶中，1～3份加入1.476mg·mL－1儲(chǔ)備液1mL；4～6份加入1.476mg·mL－1儲(chǔ)備液1.5mL；7～9份加入1.476mg·mL－1儲(chǔ)備液2.0mL；揮干甲醇，精密吸取50.00mL 50％乙醇，稱重，水浴回流提取1h，再稱重，用50％乙醇補(bǔ)足減失重量，過濾后取上述9份提取液的續(xù)濾液，在上述色譜條件下進(jìn)樣20μL，結(jié)果見表1。

2.8 樣品測定

取3份三叉苦藥材粉末，分別按供試品溶液制備項(xiàng)下方法處理，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20μL注入高效液相色譜儀，按上述色譜方法進(jìn)行測定，平行操作3次，外標(biāo)法計(jì)算含量，3份藥材中異吳茱萸酮酚的含量分別為4.76，4.79，4.75mg·g－1，平均含量為4.77mg·g－1。

表1 異吳茱萸酮酚加樣回收試驗(yàn)

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的考察

本實(shí)驗(yàn)考察了乙醇超聲提取和乙醇回流提取兩種方法制備三叉苦藥材中的異吳茱萸酮酚，結(jié)果乙醇回流提取的效率較超聲提取好。對于乙醇回流提取法，分別采用75％、50％、40％、30％乙醇進(jìn)行提取，提取時(shí)間分別設(shè)定為20min、30min、1.5h及2.0h，結(jié)果50％的乙醇回流提取1h為最佳提取方式。

3.2 色譜條件的選擇

檢測波長的選擇：本實(shí)驗(yàn)稱取約2.000g三叉苦藥材粉末，用95％乙醇50mL水浴加熱回流提取1h，取續(xù)濾液，進(jìn)樣20μL，通過Waters高效液相色譜儀中全波長檢測器掃描，選擇異吳朱萸酮酚的最大吸收波長230nm作檢測波長。

流動(dòng)相的選擇：本實(shí)驗(yàn)還對3種不同的流動(dòng)相：（1）甲醇-0.1％磷酸水（55∶45）；（2）乙腈-0.1％磷酸水（55∶45）；（3）乙腈-0.1％醋酸水（55∶45）進(jìn)行了考察，結(jié)果以乙腈-0.1％醋酸水（55∶45）為流動(dòng)相效果較好。

本實(shí)驗(yàn)采用乙醇回流提取的方法制備三叉苦供試液，以本實(shí)驗(yàn)室分離純化的異吳茱萸酮酚為對照品建立了三叉苦中異吳茱萸酮酚含量的HPLC測定方法，該方法快速、簡便、重復(fù)性好，可用于三叉苦藥材中異吳茱萸酮酚的含量測定。

［1］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典［M］.上冊.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1977：68.

［2］李國林，朱大元.三個(gè)新2，2-二甲基苯并二氫吡喃類化合物的分離與鑒定［J］.植物學(xué)報(bào)，1997，39（7）：670-674.

［3］刁遠(yuǎn)明，高幼衡，彭新生，等.三叉苦化學(xué)成分研究（I）［J］.中草藥，2004，35（10）：1098-1099.

［4］刁遠(yuǎn)明，高幼衡，彭新生，等.三叉苦化學(xué)成分研究（Ⅱ）［J］.中草藥，2006，37（9）：1309-1311.

［5］李碩果，楊茵，葉文才，等.三椏苦的化學(xué)成分研究［J］.中草藥，2010，41（7）：1052-1056.

2012年中醫(yī)藥十大新聞揭曉

日前，由國家中醫(yī)藥管理局新聞辦公室和中國中醫(yī)藥報(bào)社共同主辦的2012年中醫(yī)藥十大新聞評選揭曉。分別是：

1.中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展“十二五”規(guī)劃頒布實(shí)施，重大項(xiàng)目扎實(shí)推進(jìn)；

2.中醫(yī)藥積極參與醫(yī)改，國家實(shí)施基層中醫(yī)藥服務(wù)能力提升工程；

3.中醫(yī)藥服務(wù)貿(mào)易納入國家貿(mào)易發(fā)展戰(zhàn)略，提出用5年時(shí)間，基本建立起以國際市場需求為導(dǎo)向的中醫(yī)藥服務(wù)貿(mào)易促進(jìn)體系和國際營銷體系；

4.《藏醫(yī)藥大典》、《中國軍事本草》出版發(fā)行；

5.《中醫(yī)藥標(biāo)準(zhǔn)化中長期發(fā)展規(guī)劃綱要》頒布實(shí)施；

6.首批64家學(xué)術(shù)流派傳承工作室確定；

7.中藥首次以藥品進(jìn)入歐洲市場；

8.“養(yǎng)熊取膽”、“打通任督二脈”兩中醫(yī)藥話題引發(fā)社會(huì)關(guān)注；

9.首批15種中醫(yī)藥文化科普圖書向公眾推薦；

10.中醫(yī)藥應(yīng)急救治體系初步形成，應(yīng)對突發(fā)公共事件能力提升。

（信息來源：中國中醫(yī)藥報(bào)）

Determ ination of Isoevodionol in Evodia lepta（Spr.）M eer.by HPLC

LIHong-fu，WANG Yong，WEINa，LIYong-hui*
（School of Pharmaceutical Science，Hainan Medical University，Haikou 571101，China）

Objective：To establish the method of determine the content of isoevodionol in Evodia lepta（Spr.）Meer.by HPLC.The result provided the basis for the effective quality control and evaluation of thematerial.M ethods：The Kromasil C18column（250mm×4.6mm，5μm）was used.The mobile phase was consisted of acetonitrile-0.1％acetic acid water（55∶45）with a flow rate at 1.0mL·min－1.The column temperature was 30℃.The detection wavelenghth was230nm.Results：Therewas a good linear relationship in the range of29.5～442.8μg（r＝0.998 8）.The average recovery was 103.9％ （RSD＝0.90）.Conclusion：The method was efficient and appropriate with a good repeatability.It can be used for the control of Evodia lepta（Spr.）Meer..

Evodia lepta（Spr.）Meer.；Isoevodionol；HPLC；Benzodihydropyran

2012-06-01）

*［通訊作者］李永輝，Tel：（0898）66895337，E-mail：lyhssl＠126.com