青海藏系綿羊BMP2基因的克隆及其序列分析

宋 靜，楊發(fā)龍，陳 剛，王 杰，鐘金誠，鄭玉才

（1．重慶長壽區(qū)疫病預(yù)防控制中心，重慶 長壽 401220；2．青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810003；3．西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

“西寧毛”，又稱西寧大白毛，是青藏高原土著品種藏系綿羊所產(chǎn)白色羊毛。具有纖維粗、長、富有光澤、彈力強、拉力大、凈毛率高（約70%左右）等特點，是目前世界上粗毛類型中的優(yōu)質(zhì)毛［1］?？茖W(xué)開發(fā)利用青海藏羊這一寶貴遺傳資源，對青藏高原畜牧業(yè)的發(fā)展具有十分重要的意義。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）是 Urist（1965）［2］年對脫鈣骨基質(zhì)的成骨研究中發(fā)現(xiàn)的，存在于骨基質(zhì)中，可以誘導(dǎo)間充骨細胞分化為軟骨及骨細胞。BMP家族決定家畜不同時期的生長發(fā)育、骨骼形成，并且該家族部分成員，特別是BMP2基因，是毛囊發(fā)育所涉及的信號分子之一。BMP家族的成員在毛囊形態(tài)發(fā)生的過程中主要起抑制性作用。BMP－2／4作為毛囊發(fā)育階段的抑制物的信號途徑之一，Noggin作為BMP的抑制因子，在毛囊形態(tài)發(fā)生中對BMP的效應(yīng)起負性調(diào)節(jié)，BMP－2和BMP－4被Noggin抑制活性的平衡狀態(tài)將刺激毛囊發(fā)育的開始［3］。作為影響羊毛品質(zhì)的侯選基因，研究其在序列上與其他品種的差異，旨在為進一步尋找控制藏系綿羊羊毛性狀及品質(zhì)的主效基因提供一定的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 樣本及處理 藏系綿羊，由青海省三角城種羊場提供。采樣部位選在試驗羊體側(cè)部肩胛后緣約一掌處。局部剪毛、剃毛、清洗、碘酊涂布消毒、酒精脫碘，剪取約2cm×2cm大小皮膚，迅速在室溫生理鹽水中沖洗3次后置于高壓滅菌過的玻璃小瓶中，封口，裝入冰瓶后送至實驗室，－80℃保存。

1．2 主要試劑和儀器E．coliTop10 、pMD18－T Vector（T 載 體）、RNAiso Reagent、ExTaq酶、dNTPs，均購自日本TaKaRa生物工程有限公司；3SSpin Agarose Gel DNAPurification kit膠回收試劑盒，購自上海申能博彩科技有限公司；T4DNA連接酶，購自北京天為時代科技有限公司；DEPC、Marker（1 000bp和2 000bp）等，均購自Sigama公司。

主要儀器有凝膠成像系統(tǒng)（VerSa Doc，美國Bio－Rad公司）、PCR 儀（TGRADIEN T9700，德國Eppendorf公司）。

1．3 方法

1．3．1 皮膚中總RNA的提取和檢測 根據(jù)Sigama公司提供的總RNA的提取方法進行皮膚總RNA的提取。取凍存的皮膚組織約100mg左右，加入Trizol試劑1mL，勻漿后加0．2mL氯仿，離心后吸取上清，加入0．5mL預(yù)冷異丙醇，離心沉淀后棄上清，800mL／LDEPC乙醇洗沉淀，用DNase酶解可能殘余的基因組DNA。提取的RNA用DEPC處理的滅菌三蒸水溶解，－80℃保存。

1．3．2 引物設(shè)計及合成 參考GenBank中綿羊（Ovis aries）BMP2及大鼠18SRNA基因mRNA的序列，利用Primer 5．0軟件分別設(shè)計BMP2特異性引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。其序列分別如下：F1：5′－TGGTTTCGTGGTGGAGGT－3′；R1：5′－CATGATTCGTGGAGTTCAG－3′。

1．3．3 RT－PCR擴增目的基因 以藏系綿羊皮膚中提取的總RNA為模板，Oligo2dT為引物，用TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver．3．0試劑盒成cDNA第1條鏈，獲得樣品RNA的cDNA（s），以cDNA為模板進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃5 min；95℃30s、52℃30s、72℃30s，共40個循環(huán)；72℃10min，4℃保存。

1．3．4 重組標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的制備 PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g／L的瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶，試劑盒回收，與pMD18－T載體連接，轉(zhuǎn)化到TOP10感受態(tài)細胞中，篩選白色菌落并劃線培養(yǎng)，質(zhì)粒提取，PCR、酶切和測序鑒定。

2 結(jié)果

2．1 組織總RNA的提取和目的基因片段的擴增

提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計檢測，其OD260／OD280＝1．69，說明提取的 RNA 有較好的純度。經(jīng)RT－PCR擴增，獲得350bp左右的片段，序列測定表明，獲得的目的條帶同原始序列的同源性為100%。

2．2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定 將RT－PCR獲得的目的片段連接到pMD18－T載體進行克隆。挑取單個白色菌落分別培養(yǎng)于2mL LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，并提取質(zhì)粒作為模板進行PCR擴增，電泳后得到356bp左右的片段，與預(yù)期結(jié)果一致，結(jié)果如圖1。說明目的片段成功插入到pMD18－T載體中，所得重組子為含有BMP2基因cDNA插入片段的重組陽性克隆質(zhì)粒。

圖1 藏系綿羊KAP6．1基因RT－PCR結(jié)果

2．3 測序結(jié)果 克隆基因測序結(jié)果僅獲得藏系綿羊BMP2基因356bp的部分CDS區(qū)，編碼118個氨基酸。用DNAMAN 4．0對藏系綿羊BMP2基因編碼區(qū)進一步分析可知，其堿基組成為A（24．72%）、C（26．40%）、T（20．79%）、G（28．09%）。其中嘧啶堿基（C＋T）占47．19%，嘌呤堿基（A＋G）占52．81%，GC含量為54．49%。

2．4 藏系綿羊BMP2基因cDNA編碼區(qū)核苷酸序列和氨基酸序列與其他物種的比較 將藏系綿羊BMP2基因編碼區(qū)核苷酸序列與GenBank中普通綿羊（AF508028．1）、山 羊 （EU854586．1）、牛 （NM－0010－99141．1）、大鼠（NM－007553．2）、豬（EU854587．1）、馬（AY008772．1）、兔（NM－001082650．1）和人（NM－001200．2）8個物種BMP2基因mRNA序列進行比較，并計算序列間同源性大小（表1，圖2）。結(jié)果表明，青海藏系綿羊與綿羊親緣關(guān)系最近，同源性為100%；其次是山羊，有1處核苷酸差異，同源性99．44%；再次是牛和豬，有7處和28處核苷酸差異，同源性分別為98．03%、91．80%；馬、大鼠和人與青海藏系綿羊分別都有43處核苷酸差異，但同源性分別為87．89%、87．61%、和87．17%、；而兔與青海藏系綿羊有46處核苷酸差異，同源性為87．04%。

由核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列比較可知，藏系綿羊BMP2基因編碼的氨基酸序列與普通綿羊、山羊和牛的同源性均為100%；與豬、馬、大鼠、人和兔的同源性為96．61%、95．76%、94．92%、94．62%和94．07%。

圖2 藏系綿羊BMP2核苷酸序列和由其推導(dǎo)的氨基酸序列下劃線為引物序列

表1 7個物種KAP6．1編碼區(qū)核苷酸序列同源性及距離陣距

圖3 7個物種KAP6．1編碼區(qū)核苷酸序列同源樹

2．5 物種間分子系統(tǒng)進化樹分析 利用DNAMAN4．0、BioEdit4．8、Mega4．0等生物軟件對藏系綿羊、普通綿羊、山羊、牛、兔、鼠和人的核苷酸序列分別構(gòu)建分子間系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3，圖4）。結(jié)果表明，兩種方法構(gòu)建的物種間分子系統(tǒng)進化樹結(jié)果基本一致，藏系綿羊與普通綿羊先聚在一起，再與山羊聚為一類，而后與牛和兔聚在一起，最后與鼠和人聚為一類。

圖4 7個物種KAP6．1編碼區(qū)核苷酸序列分子系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

本試驗通過RT－PCR技術(shù)首次從青海藏系綿羊皮膚中克隆得到了長為356bp的藏系綿羊BMP2基因cDNA序列，包含一個不完整的編碼區(qū)。初步分析表明，通過多物種BMP2基因片段的序列比對分析，生物進化樹的繪制，青海藏系綿羊BMP2基因部分cDNA核苷酸序列與其他哺乳動物同源性很高。與普通綿羊、山羊、牛、馬、豬、大鼠、兔和人的核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性分別高達87．04%和94．07%以上。初步分析，青海藏系綿羊和普通綿羊核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性均為100%。山羊與青海藏系綿羊和普通綿羊在進行編碼區(qū)核苷酸序列比對時，只有一處差異，即編碼第一位氨基酸－甘氨酸的第3位密碼子由T變?yōu)镚，但由其編碼的氨基酸并沒有發(fā)生改變，所以山羊與青海藏系綿羊和普通綿羊核苷酸序列同源性為99．44%，但其氨基酸序列同源性為100%。藏系綿羊與普通綿羊、山羊、牛、兔、鼠及人之間分子系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建，結(jié)果表明，BMP2基因在不同物種之間具有較高的保守性，BMP2基因編碼區(qū)適用于進行不同物種間起源進化和種系發(fā)生關(guān)系的研究。

BMP2是骨形態(tài)發(fā)生蛋白成員之一，屬于TGF－β1超家族成員，具有分泌型蛋白的特征，其生物活性很高，不僅具有促進軟骨和骨組織形成的作用，而且證實對骨組織，腦組織和脊髓組織的生長、發(fā)育、分化有重要的調(diào)節(jié)作用，并參與細胞凋亡和細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)，同時BMP2作為毛囊誘導(dǎo)的抑制物對于動物的毛囊形成和發(fā)育具有一定的調(diào)控作用。BMPs其他方面的生物學(xué)活性也是跨種屬的，這都與BMPs的結(jié)構(gòu)在種屬間高度保守相一致［4］。序列分析顯示出明顯進化上的保守性和高度序列同一性，這種同源性在一定程度上代表著物種親緣關(guān)系的遠近，同時也反映了其對生物體的功能重要性。這對BMP2基因功能和調(diào)控的研究有重要的意義，也為下一步青海藏系綿羊BMP2全長基因的克隆、表達以及基因功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

［1］ 木也．西寧毛［J］．中國土特產(chǎn)，1997（2）：35．

［2］ Urist M R．Bone：formation by autoinduction［J］．Science，1965，150（698）：893－899．

［3］ Botehkarev V A，Botehkareva N V，Roth W，1999a，Noggin is a mesenehymally－derived stimulator of hair follicle induction［J］．Nature Cell Biol，1999a，1：158－164．

［4］ 潘貴超，溫建民，潘貴春．骨形態(tài)發(fā)生蛋白－2的研究進展［J］．中國中醫(yī)骨傷科雜志，2006，14（6）：78－90．