25份普通煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性的SSR 標記分析

楊 柳，汪 斌，童治軍，黃勇兵，曹梅秀，吳海喬，巫升鑫，陳順輝，蘭 濤

(1.福建農(nóng)林大學作物遺傳育種與綜合利用教育部重點實驗室，福建福州350002;2.浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術學院，浙江杭州310058;3.福建省煙草科學研究所，福建福州350003)

煙草(Nicotiana tabacum)是我國重要的經(jīng)濟作物，我國煙草種質(zhì)資源十分豐富.目前已有66個煙屬植物種被發(fā)現(xiàn)，其中可直接利用的栽培種只有普通煙草(包括烤煙、白肋煙、雪茄煙、香料煙和曬晾煙)和黃花煙草(Nicotiana rusitica L.)［1］.近年來，DNA分子標記在作物種質(zhì)資源研究、遺傳圖譜構建、基因定位以及分子標記輔助育種等方面得到廣泛應用，常用的分子標記有RAPD、RFLP、AFLP、SSR、ISSR和SRAP等［2－6］.

SSR(simple sequence repeat)標記是一種基于PCR的分子標記，具有共顯性遺傳、多態(tài)性高、信息量大和對DNA質(zhì)量要求低等諸多優(yōu)點，在植物遺傳多樣性研究上已被廣泛應用.煙草SSR標記的開發(fā)較晚，2007年Bindler et al［7］首次公布了一張煙草微衛(wèi)星標記遺傳圖譜，該圖譜利用282對SSR引物擴增出293個基因座，分布于24個連鎖群上.2011年，Bindler et al［8］又開發(fā)了5119對SSR引物，構建了包含2137個SSR標記、2163個基因座的高密度煙草SSR遺傳圖譜.與其它常用分子標記相比，目前有關煙草SSR標記應用于煙草遺傳多樣性研究的報道相對較少.徐軍等［9］利用8對煙草SSR引物構建了80份煙草種質(zhì)指紋圖譜.劉傳勝等［4］利用8對煙草SSR引物對32份代表性煙草種質(zhì)進行了遺傳多樣性分析.本研究采用已公布的20對和新開發(fā)的82對煙草SSR引物對25份普通煙草種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，以期探討SSR標記技術在煙草品種親緣關系的鑒定及遺傳多樣性研究上的應用，為煙草品種的鑒定、遺傳分類、遺傳育種等提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

25份煙草材料包含烤煙17份、白肋煙2份、香料煙3份、雪茄煙2份和曬晾煙1份，分別來自美國、中國、阿爾巴尼亞、日本等國家，由福建省煙草農(nóng)業(yè)科學研究所提供(表1).

表1 供試煙草的名稱、類型及來源Table 1 The names，types and origins of experiment materials

1.2 方法

1.2.1 煙草DNA的提取 分別采集各供試材料的幼嫩煙草葉片(25－28℃下溫室培養(yǎng)，光照12 h·d－1)，稱取3 －5 g;采用稍加改良的 CTAB 法［10］提取基因組DNA;將DNA 濃度稀釋到20 －50 ng·μL－1，4℃保存?zhèn)溆?

1.2.2 SSR分析 采用102對SSR引物對部分供試材料進行擴增和電泳，從中篩選出條帶清晰、多態(tài)明顯的SSR引物.利用選出的SSR引物對25份煙草材料進行SSR分析，102對引物中20對是Bindler et al開發(fā)的引物，82對是由浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術學院和福建農(nóng)林大學合作開發(fā)的煙草SSR新引物.

PCR 反應體系(20 μL):2 μL 10 × PCR Buffer，1 μL dNTP(2.5 mmol·L－1)，1.5 U Taq DNA Polymerase，2 μL DNA 模板，上下游引物(5 μmol·L－1)各 1 μL，剩余用 ddH2O 補齊.

PCR反應程序:94℃預變性5 min，94℃變性30 s;57℃(視引物而定)退火30 s;72℃延伸30 s(39個循環(huán));最后72℃延伸10 min.

PCR擴增產(chǎn)物用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和快速銀染法［10］分析，穩(wěn)定電壓220 V，電泳2 h左右.

1.3 數(shù)據(jù)處理

選擇清晰可辨的電泳主條帶進行統(tǒng)計分析，按擴增條帶的有無記數(shù)，在相同遷移率位置上，有帶記為“1”，無帶記為“0”.引物的鑒別能力用多態(tài)信息量(PIC)表示，PIC=1－其中n為該位點的等位基因數(shù)，Pi為第i個等位基因在群體中的頻率，Pj為第j個等位基因在群體中的頻率，PIC值由PIC_CALC Version 0.6軟件計算得出.

應用NTSYSpc 2.10e分析軟件，按文獻［11］的方法統(tǒng)計任意2份種質(zhì)的遺傳相似系數(shù) GS=2Nij/( Ni+Nj)，其中Nij為i、j 2份種質(zhì)共有的等位基因數(shù)，Ni和Nj分別代表i、j種質(zhì)的等位基因數(shù).遺傳距離GD=1－GS，然后采用非加權組平均法進行聚類分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR 標記

2.1.1 SSR引物鑒別能力 對102個SSR標記進行篩選，發(fā)現(xiàn)14對引物能擴增出穩(wěn)定清晰的多態(tài)性條帶(表2).利用這14對引物對25份煙草種質(zhì)進行PCR擴增及電泳分析，其中引物PT20213的擴增結(jié)果見圖1.

表2 14對SSR引物名稱、序列及退火溫度Table 2 The names，sequences and annealing temperatures of 14 pairs of SSR primers

圖1 引物PT20213對25份煙草基因組DNA的擴增結(jié)果Fig.1 Result of DNA amplification of 25 tobacco DNA using primer PT20213

在14個SSR位點上，共檢測到97個等位基因片段，每個位點上有4－10個等位基因，平均每對引物可檢測到的等位片段數(shù)為6.9個.引物的PIC值為0.53－0.815，平均值為0.694，說明這些引物總體上具有很好的鑒別能力.其中引物TM11227的PIC值最高，為0.815.這種高鑒別力的引物只需較少的用量就能將所有供試材料區(qū)分開來(表3).

2.1.2 特異SSR標記 某些引物可在一些材料中擴增出特異條帶，從而用1對這樣的SSR引物就能將某些種質(zhì)單獨區(qū)分出來.14對SSR引物中除TM10180外，均可在特字401、長勃黃、閩煙7號、B07-8、花溪大青桿、Burley21、Basma Llovina、新昌香料煙、Xanthi NO-1、鐵桿青、督葉尖干種和打洛曬煙12份煙草種質(zhì)中擴增出特異性條帶，從而能特異性地區(qū)分其中之一或同時區(qū)分幾份煙草種質(zhì).如引物TM10089可將花溪大青桿、Basma Llovina、Xanthi NO-1、鐵桿青和督葉尖干種5個材料單獨區(qū)分開.而某些煙草種質(zhì)的特異引物不止 1條，如 Basma Llovina有 6條特異引物(PT21213、PT20372、TM10089、TM10811、TM11166和TM11097);鐵桿青有5條特異引物(PT20213、TM10089、TME0082、TPM10899和TM11215).其中3種香料煙有4－6條特異引物，2種雪茄煙分別有3條和5條特異引物，而只有少數(shù)烤煙僅有1－2條特異引物，表明普通煙草中烤煙品種內(nèi)的遺傳差異相對較小.

2.2 遺傳相似性與差異性

利用這14對SSR引物對25個煙草種質(zhì)基因組進行PCR電泳檢測后得到〔0，1〕矩陣，先計算出不同種質(zhì)間的GS，得到25份煙草種質(zhì)間的GS為0.701－0.959，平均值為0.787.其中Coker176與花溪大青桿、Basma Llovina、Xanthi No.1、督葉尖干種的 GS最小，表明其遺傳差異較大;而 Coker347與 K358、G80，G80與巖煙97的GS最大，表明其遺傳差異最小.通過分析普通煙草種類內(nèi)的遺傳多樣性水平，發(fā)現(xiàn)17份烤煙平均GS達到0.821，整體遺傳差異較小;2種白肋煙的GS高達0.918，遺傳差異也很小，3種香料煙之間的平均GS相對較小(0.718)，表明其遺傳差異較大.烤煙類型與白肋煙、香料煙、雪茄煙、曬煙類型間的平均GS為0.736－0.760，表明其具有一定的遺傳多樣性.

表3 14對煙草SSR引物的擴增結(jié)果Table 3 Amplification results of 14 pairs of tobacco SSR primers

2.3 煙草種質(zhì)的聚類分析

為了確定25份煙草種質(zhì)在基因組上的遺傳關系，利用SSR的GS矩陣按UPGMA方法進行聚類，構建了各個供試煙草材料的親緣關系(圖2).

圖2 25份煙草材料的SSR聚類圖Fig.2 Cluster dendrogram of 25 tobacco germplasms based on SSR markers

在GS為0.766(L1)處，可以將25份煙草材料分為五大類:第1大類包括15份烤煙種質(zhì)(1－8和11－16);第2大類包括2種白肋煙(18、19號)和1種烤煙(9號);第3大類包括20號香料煙Basma Llovina和25號打洛曬煙;第4大類包括2種香料煙(21和22號)和2種烤煙(10、17號);第5大類包括雪茄煙23、24號.其中長勃黃、紅花大金元和花溪大青桿與其它烤煙的差異比較明顯.上述分類與普通煙草按品種特性、調(diào)制類型的分類(烤煙、晾曬煙、白肋煙、香料煙和雪茄煙)不完全相同，說明兩者之間沒有必然聯(lián)系.

在L2=0.85分割線處，第3、4、5大類中的材料均各自單獨聚為一類;而第2大類中2種白肋煙與烤煙長脖黃區(qū)分開.此時GS比較高的第1大類烤煙被分為3類:源自美國的特字401單獨聚為第1小類;第2小類包括11個烤煙種質(zhì)，其中7個來源于美國，其余4個均由國外一些優(yōu)良品種培育而來;第3小類為福建省的2個烤煙翠碧一號(15)和B07-8(16號).將這11份烤煙再細分(L3=0.895):其中K346、K358、G80、巖煙97(G80的衍生種)、Coker 347、Coker 176、系3歸為一類;來自美國的烤煙D101和SPG-117歸為一類;國內(nèi)的烤煙云煙85和閩煙7號(云煙85×Coker347)歸為一類.其中福建的5個烤煙品種(翠碧一號、B07-8、系3、巖煙97和閩煙7號)并未按地域歸為一類，而是與其各自的親本聚在一起.這種聚類與煙草種質(zhì)的育成親本來源有關，但與其地域來源沒有必然聯(lián)系.

3 討論

Coussirat［12］最早將RAPD技術用于煙草遺傳差異性的研究，采用160個RAPD隨機引物分析32份煙草種質(zhì)的遺傳差異，其中9個引物擴增出29條多態(tài)性條帶，占引物總數(shù)的5.63%.王志德等［13］采用43個RAPD引物對24份煙草核心種質(zhì)進行了分析，共擴增出214個條帶，平均每個引物擴增條帶數(shù)為4.98.可見將RAPD技術應用于煙草種質(zhì)遺傳多樣性分析的效率較低.

Moon et al［14］利用46對SSR引物對54份煙草屬材料進行了聚類分析，得到的結(jié)果與傳統(tǒng)的基于形態(tài)學、細胞學及分子學的觀察分類結(jié)果一致.葉蘭欽等［15］運用Bindler發(fā)表的92個SSR標記分析13個云南省煙草主栽品種的遺傳多樣性，在有多態(tài)的20個SSR基因座上共檢測到52個等位片段，平均每對引物檢出等位片段數(shù)為2.6個，引物多態(tài)性約22%.徐軍等［9］利用Bindler發(fā)表的286對SSR引物中多態(tài)性較好的8對引物，構建了80份普通煙草種質(zhì)的指紋圖譜，檢測到的多態(tài)性位點85個，平均PIC值為0.81.本研究從Bindler發(fā)表的20對和82對待發(fā)表的SSR引物中篩選出14對多態(tài)性引物(占14%)，共檢測到97個等位片段，平均每對引物等位片段數(shù)為6.9個，平均PIC值達到0.694.這些引物能在某些煙草種質(zhì)中擴增出特異帶的標記，可作為單獨區(qū)分這些種質(zhì)的候選標記.說明SSR標記可有效用于煙草種質(zhì)遺傳多樣性研究.

本試驗采用SSR標記對25份普通煙草種質(zhì)的擴增結(jié)果表明，GS為0.701－0.959，GS平均值為0.787，17份烤煙種內(nèi)平均GS達到0.821，表明其遺傳相似性較高，這與以往大部分的研究結(jié)果一致［16－18］.聚類分析結(jié)果表明普通煙草種質(zhì)間的遺傳差異與其品種特性、調(diào)制類型、地理來源的差異沒有必然聯(lián)系，這與梁景霞等［19］、王志德等［13］、肖炳光等［20］的研究結(jié)果相符.普通煙草種質(zhì)間的品種特征、調(diào)制類型的差異，大多是在特定生態(tài)環(huán)境和長期人工選擇中逐漸形成的，但種質(zhì)間的遺傳差異與其血緣密切相關.國內(nèi)培育的一些烤煙種質(zhì)與各自的親本聚在一起，體現(xiàn)了一定的品系形成規(guī)律.如由云煙85×Coker347雜交選育而來的閩煙7號與其親本之一云煙85聚在一起，表明其遺傳相似性很高.

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