桃金娘果實中多糖的提取與含量測定

陳筱云 羅朝暉

1.柳州市紅十字會醫(yī)院藥劑科，廣西柳州 545001；2.桂林醫(yī)學院，廣西桂林 541004

桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa（Ait.）Hassk），俗稱山稔子、崗稔、當梨等，為桃金娘科植物桃金娘果實。分布于江西、福建、臺灣、廣東、海南、廣西、云南及貴州等省區(qū)。果實成熟完全時極甜，略有澀味，汁液呈誘人的紫紅色，富含多糖、黃酮類、酚類、氨基酸、有機酸等多種化學成分，我國民間素有將其泡酒飲用的習慣，有“養(yǎng)血，止血，澀腸，固精”的功效[1-2]。因此，它具有較高的研究和開發(fā)利用價值。

多糖是由10個以上單糖通過苷鍵連接而成的糖。自然界分布極廣，目前已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種多糖具有多種生物活性，如具有提高免疫功能，抗衰老，抗腫瘤，抗病毒，抗?jié)儯笛牵笛?，抗氧化，抗自由基和增加各類細胞因子表達的作用[3]。本文采用水提醇沉法提取桃金娘多糖，用苯酚-硫酸法測定其含量，為開發(fā)利用桃金娘資源提供理論依據(jù)。

1 主要儀器、試劑及材料

BT224S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；紫外分光光度計（日本島津UV-2550）；R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀及201-恒溫水浴鍋（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；電熱套；離心機；干燥箱；循環(huán)水式真空泵。

標準葡萄糖、苯酚，濃硫酸、石油醚（60～90℃）、95%乙醇、氯仿、正丁醇、無水乙醇、乙醚、丙酮均為分析純。

桃金娘果實采于桂林市永福縣（9～10月份），藥材經(jīng)桂林醫(yī)學院生藥教研室杜澤鄉(xiāng)副教授鑒定，為桃金娘科植物桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa（Ait.）Hassk）果實，冷藏保鮮。

2 實驗方法

2.1 桃金娘多糖提取工藝

稱取新鮮桃金娘果實500 g，用剪刀稍剪開后置2000 mL圓底燒瓶中，加石油醚900 mL，80℃水浴回流提取1.5 h，重復提取1次（600 mL，1 h），濾出溶劑，濾渣揮干溶劑后加80%乙醇1000 mL，浸泡過夜（約13 h）后90℃水浴回流提取1 h，重復提取1次（500 mL，1 h），濾過，濾渣揮干溶劑后加600 mL蒸餾水95℃水浴回流提取1 h，再重復提取3次，合并4次提取液，減壓濃縮至200 mL，以每100 mL濃縮液加20 mL氯仿-正丁醇（4：1）液，置分液漏斗中振搖20 min，離心15 min，去除下層氯仿及中層變性蛋白，取上部水層再重復操作至無明顯中層為止。上清液加3倍量95%乙醇沉淀多糖，4℃冰箱放置45 h，抽濾，沉淀依次用無水乙醇，丙酮，乙醚洗滌4次（20 mL/次），得桃金娘多糖，置60℃烘箱干燥至恒重得2.78 g，放入干燥器中保存?zhèn)溆肹4]。

2.2 苯酚溶液的配制

加熱苯酚使其溶解，趁熱取100 g，加鋁片0.1 g和碳酸氫鈉0.05 g置150 mL圓底燒瓶中，電熱套加熱（182℃）蒸餾收集餾分至棕色瓶中備用，趁熱從中精密稱取5 g置100 mL棕色容量瓶中，加水定容至刻度，即得5%苯酚溶液（臨用前新配）[5]。

圖1 最大吸收波長掃描圖

2.3 葡萄糖標準溶液的配制

精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖0.1014 g置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，混勻后從中精密吸取10.0 mL置100 mL容量瓶定容至刻度，即得0.1014 mg/mL的標準葡萄糖溶液。

2.4 最大吸收波長的選擇

精密吸取0.1014 mg/mL標準葡萄糖溶液1.0 mL，置10 mL具塞試管中，加5%苯酚溶液1.0 mL，混勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，混勻，陰暗處放置10 min后置沸水浴中加熱15 min，取出立即冷卻后陰暗處放置20 min。以蒸餾水同法操作為空白對照，于400～550 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在487 nm處有最大吸收（如圖1），因此選擇測定波長為487 nm。

2.5 標準曲線的繪制

精密吸取0.1014 mg/mL標準葡萄糖溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、0.9 mL分別置10 mL具塞試管中，再分別加蒸餾水至1.0 mL，然后分別加5%苯酚溶液1.0 mL，混勻，再迅速加濃硫酸5.0 mL，混勻，陰暗處放置10 min后置沸水浴中加熱15 min，取出后立即冷卻，陰暗處放置20 min，以蒸餾水1.0 mL同法操作為空白對照，照紫外分光光度法在487 nm處測定吸光度A，以葡萄糖濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制標準曲線，做回歸處理，得回歸方程為A=0.07376C+0.0036，相關系數(shù)r2=0.99967，葡萄糖在1.449～13.037 μg/mL范圍內(nèi)與A呈良好的線性關系[6]。

2.6 換算因子的測定

精密稱取干燥至恒重的桃金娘多糖21.67 mg置100 mL容量瓶中，加溫熱的蒸餾水溶解并稀釋至刻度，從中精密吸取1.0 mL，3份分別置10 mL具塞試管中，照標準曲線制作項下方法自“加5%苯酚溶液1.0 mL起，依法測定吸光度，求平均吸光度、RSD。由回歸方程求出該多糖液中葡萄糖的濃度C，按下式計算換算因子。換算因子f=W/CD（式1）[7]。

式中W為稱取多糖的重量μg；C為該多糖液中葡萄糖的濃度μg/mL；D為多糖的稀釋倍數(shù)。

2.7 樣品中桃金娘多糖的含量測定[7]

2.7.1 樣品溶液的制備 取桃金娘鮮果一個精密稱取得1.8480 g，置150 mL圓底燒瓶中，用玻棒稍壓破后加80%乙醇50 mL，90℃水浴攪拌回流提取1 h，趁熱抽濾，濾渣用80%乙醇洗滌兩次，揮干溶劑后加熱水60 mL于95℃水浴攪拌回流提取2 h，抽濾，濾渣用熱水多次洗滌，濾液用容量瓶定容至200 mL，即得樣品溶液。

2.7.2 樣品溶液中多糖的含量測定 精密吸取樣品溶液1.0 mL（3份），置10 mL具塞試管中，照2.5方法測定吸光度A，由回歸方程計算樣品溶液中葡萄糖的濃度C，按照下式計算含量。

多糖含量（%）=CDf/W×100%（式2）

式中D為樣品溶液的稀釋倍數(shù)，W為樣品的取樣量（μg），f為換算因子，C為樣品溶液中葡萄糖的濃度（μg/mL）。

2.8 方法學考察

2.8.1 穩(wěn)定性試驗 精密吸取樣品溶液1.0 mL，置10 mL具塞試管中，照2.5方法測定吸光度A，每隔30 min測定一次，共測4次（2 h內(nèi)），考察生成物顏色的穩(wěn)定性。

2.8.2 重現(xiàn)性試驗 取桃金娘鮮果3個，分別精密稱取得1.8480、1.7869、1.7351 g，照2.7.1項下制備得溶液a、b、c，每份精密吸取1.0 mL各3份共9份，分別置10 mL具塞試管中，再照2.5方法測定吸光A，計算多糖的含量并求平均值。

2.8.3 加樣回收率試驗 精密吸取樣品溶液5.0 mL，3份分別置10 mL容量瓶中，再按高、中、低三個濃度分別加0.1014 mg/mL的標準葡萄糖溶液2.7、3.4、4.1 mL，加水定容至10 mL，即得加樣液①、②、③，從中各取1.0ml3份共9份分別置10 mL具塞試管中，照2.5方法測定吸光度A，計算加樣回收率。

3 實驗結(jié)果與結(jié)論

3.1 實驗結(jié)果

3.1.1 換算因子 測得的數(shù)據(jù)A1=0.756，A2=0.739，A3=0.733，平均吸光度A=0.743，RSD=1.61%＜2%，將A代入回歸方程A=0.07376C+0.0036得C=10.024μg/mL

由式1計算換算因子f=W/CD=21.67×103/10.024×700=3.088

3.1.2 多糖含量及重現(xiàn)性 由回歸方程求出樣品液中葡萄糖的濃度C（μg/mL），由式2計算多糖平均含量為2022%，RSD=4.13%，可見重現(xiàn)性較好，方法可行。

3.1.3 穩(wěn)定性 苯酚-硫酸顯色后，樣品溶液在2 h內(nèi)吸光度在0.725～0.733之間，基本穩(wěn)定。

表1 加樣回收率結(jié)果

3.1.4 加樣回收率 測得數(shù)據(jù)及計算結(jié)果見表1，證明了該含量測定的方法可靠。

3.2 實驗結(jié)論

本實驗通過水提醇沉法從桃金娘鮮果中提取了多糖，得到淺棕色片狀桃金娘多糖，苯酚-硫酸顯色呈棕紅色。用苯酚-硫酸比色法測定桃金娘鮮果中多糖的含量，最大吸收波長為487 nm，顯色條件為1.0 mL，5%苯酚溶液、5.0 mL濃硫酸、反應時間15 min，濃度在1.449～13.037 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關系，測得多糖含量為2.22%?？梢姡迷摲椒y定桃金娘果實中多糖的含量是可行的，其方法穩(wěn)定可靠，簡單易行，為研究桃金娘果實中的多糖成分提供實驗依據(jù)。對于其他提取與含量測定的方法及該多糖組分的鑒定還有待進一步研究。

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