模擬介入圍手術(shù)期IFN－α聯(lián)合ATRA治療肝癌的效果觀察＊

趙書元，吳李鳴

（1.河南省駐馬店市中心醫(yī)院放射科 463000；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院肝膽胰外科，杭州310003）

中國的原發(fā)性肝癌病例約占全世界病例的42.5%，且一半以上的患者合并有不同程度的肝硬化與乙型肝炎［1］。對于失去外科手術(shù)機(jī)會的患者，臨床上常對其使用肝動脈化療栓塞術(shù)（TACE）進(jìn)行治療，近年來TACE得到了廣泛的普及，明顯改善了患者的預(yù)后，提高了患者的生活質(zhì)量［2－3］。但單純的化療栓塞術(shù)常常無法達(dá)到最佳的治療效果，殘存的肝癌細(xì)胞造成了后期的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)，影響了整個治療的遠(yuǎn)期效果。全反式維甲酸是維生素A的衍生物，也是一類十分重要的誘導(dǎo)分化劑，實驗表明其能夠使得P53與Fas等癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)增高，并對 Bcl－2形成抑制作用［4］。而干擾素－α（IFN－α）對于惡性腫瘤在體內(nèi)的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移也有著一定的抑制作用，本研究探討介入圍手術(shù)期IFN－α聯(lián)合全反式維甲酸（ATRA）治療肝細(xì)胞癌的療效，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2只5周齡的BALB／c雄性裸小鼠［中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供，合格證編號：SCXY（京）－2012－0004］，在IVC環(huán)境中對其進(jìn)行飼養(yǎng)，所有飼料與飲水均無菌，飼養(yǎng)環(huán)境無病原體。將肝癌細(xì)胞CBRH7919的細(xì)胞懸濁液接種于裸鼠皮下，每只所接種的細(xì)胞數(shù)為1×107。14d后，將接種肝癌細(xì)胞的裸鼠處死，取出瘤體組織。將瘤體切成長寬厚分別為2、2、1mm的小瘤塊，并接種于28只Wistar大鼠（購自復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物科學(xué)部）。將所有Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)法隨機(jī)分為實驗組與對照組，各14只。實驗組雄、雌各7只，平均（182.9±37.2）g；對照組雄、雌各7只，平均（183.7±36.6）g。兩組大鼠的性別及體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法 大鼠在接受瘤體移植1個月后，將所有大鼠的肝動脈進(jìn)行結(jié)扎。實驗組接受IFN－α（1 000U／g，2日／次）與ATRA（0.02mg／g，1日／次）腹腔注射，對照組接受相同劑量的生理鹽水腹腔注射。10d后，取大鼠的下腔靜脈血1mL，于37℃的環(huán)境下放置5h，將標(biāo)本放入離心機(jī)進(jìn)行離心5min（3 000r／min），分離血清后將其放置于－80℃的冰箱中保存。將所有Wistar大鼠處死，分離腫瘤組織，將標(biāo)本放置于－80℃的冰箱中保存。測定血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）的mRNA的表達(dá)水平時，將腫瘤組織取出，稱質(zhì)量，將液氮加入研缽，在將標(biāo)本磨勻后加入1mL TRIzol，混勻后加入到Eppendorf管中并加入氯仿，振蕩混勻后放入離心機(jī)離心15min（4℃，12 000r／min）。吸取上清液后將其置于另一個Eppendorf管，加入相同體積的異丙醇后混勻，再次離心10min（4℃，12 000r／min）。離心完畢后將上清液吸除，將濃度為75%的乙醇加入以對剩余的沉淀物進(jìn)行清洗，離心后將后加入的乙醇棄除。待沉淀干燥后加入DEPC水，形成RNA溶液，采用核酸－蛋白檢測儀檢測RNA濃度，并配置瓊脂凝膠電泳對RNA的完整性進(jìn)行驗證。VEGF與bFGF蛋白的表達(dá)水平及腫瘤微血管密度采用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行檢測，外周血的VEGF水平采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測，腫瘤細(xì)胞的凋亡指數(shù)采取流式細(xì)胞儀及TUNEL進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，兩組數(shù)據(jù)間計量資料使用兩獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組VEGF水平、腫瘤微血管密度及腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 實驗組VEGF水平、腫瘤微血管密度及腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2 逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）檢測bFGF及VEGF mRNA表達(dá)水平情況比較 實驗組RT－PCR檢測的bFGF及VEGF mRNA表達(dá)水平要明顯少于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1、2。

2.3 兩組免疫組織化學(xué)法檢測的bFGF及VEGF蛋白表達(dá)比較 實驗組與對照組免疫組織化學(xué)法檢測的bFGF及VEGF蛋白表達(dá)結(jié)果與RT－PCR檢測的結(jié)果一致，實驗組上述兩種蛋白的表達(dá)均低于對照組，見圖3。

表1 兩組VEGF水平、腫瘤微血管密度及腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（±s）

表1 兩組VEGF水平、腫瘤微血管密度及腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（±s）

組別 n VEGF（pg／mL）腫瘤微血管密度（個／HP）腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)（%）14 91.8±12.7 115.7±11.8 12.29±4.53對照組 14 67.4±18.3 65.3±7.2 3.81±1.52 t 4.099 13.642 6.640 P實驗組0.000 0.000 0.000

圖1 兩組RT－PCR檢測bFGF mRNA的表達(dá)情況

圖2 兩組RT－PCR檢測VEGF mRNA的表達(dá)情況

圖3 免疫組織化學(xué)法檢測的bFGF及VEGF蛋白表達(dá)

3 討 論

原發(fā)性肝細(xì)胞癌的病情進(jìn)展快且隱匿性強(qiáng)，臨床上手術(shù)切除率不足1／3，TACE的出現(xiàn)使得無法手術(shù)的患者獲得了一種新的治療機(jī)會［5－6］。但通過對肝癌患者術(shù)后的病情進(jìn)行監(jiān)測，許多學(xué)者都發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)的癌基因Bcl－2的表達(dá)在術(shù)后發(fā)生上調(diào)，其對肝癌細(xì)胞的誘導(dǎo)程度增強(qiáng)，患者的遠(yuǎn)期預(yù)后也因此受到影響。TACE術(shù)后雖然腫瘤的部分血管被栓塞，但腫瘤在缺氧的情況下生成了較多的側(cè)支循環(huán)，殘留的癌細(xì)胞造成了癌癥的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移［7］。

VEGF與bFGF是惡性腫瘤細(xì)胞所分泌的數(shù)十種生長因子中作用最為重要的兩種因子，其誘發(fā)了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移［8］。VEGF在乳腺癌、肺癌、大腸癌及胃癌等惡性腫瘤中的表達(dá)與腫瘤微血管的密度關(guān)系緊密，且對于患者的遠(yuǎn)期預(yù)后有著一定的預(yù)測價值。本研究結(jié)果顯示，實驗組VEGF與bFGF的表達(dá)要顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。腫瘤內(nèi)部微血管的生成過程十分復(fù)雜，主要包括細(xì)胞外基質(zhì)與基底膜發(fā)生降解，細(xì)胞外基質(zhì)的增殖，新生血管腔的形成并相互吻合成網(wǎng)［9］。在整個過程中，血管生成因子與抑制因子相互協(xié)調(diào)，血管生成的減少與血管生成因子水平的下降直接相關(guān)。VEGF是一種極為重要的血管生成因子，其作為一種特異的內(nèi)皮細(xì)胞分裂源能夠大大增加血管的通透性，目前已有許多研究的結(jié)果證明VEGF水平的高低是惡性腫瘤患者預(yù)后的獨立預(yù)測因素［10］。IFN－α能夠?qū)FGF的表達(dá)形成抑制作用，從而對新生腫瘤血管起到抵抗的效果，其機(jī)制主要是血管內(nèi)皮細(xì)胞在IFN－α的作用下對血管生成因子的敏感性降低。ATRA的生物學(xué)活性主要是由細(xì)胞核內(nèi)部的視黃素X受體與維甲酸受體所介導(dǎo)，其能夠使P53與Fas等抑癌基因的表達(dá)增加，并使得Bcl－2的表達(dá)受到抑制，最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡或分化。除自身所具備的生物學(xué)活性之外，ATRA還能夠?qū)ρ苌梢蜃拥幕钚云鸬矫黠@抑制的作用。體外實驗表明，即使在視黃素的濃度處于中等或以下時，ATRA仍能夠?qū)EGF、bFGF等血管生成因子的表達(dá)起到較為明顯的抑制作用［11］。另一方面，ATRA還能夠?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞的遷移及層粘連蛋白、膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的代謝起到抑制的作用。將ATRA與IFN－α聯(lián)合起來在介入圍手術(shù)期配合化療栓塞術(shù)，能夠充分起到栓塞壞死、化療殺傷、分化誘導(dǎo)的作用［12－15］。作為多血管惡性腫瘤，通過對新生血管的抑制能夠在根本上對腫瘤的生長及進(jìn)一步的轉(zhuǎn)移起到及有意義的干預(yù)。

綜上所述，介入圍手術(shù)期IFN－α聯(lián)合ATRA的使用能夠抑制新生腫瘤血管的生成，提高介入手術(shù)的臨床療效。

［1］ 鄭青平，倪秉強(qiáng)，伍美娟，等.肝癌放療前后血漿VEGF表達(dá)的臨床意義［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2010，39（3）：288－289，291.

［2］ Nagano H，Kobayashi S，Marubashi S，et al.Combined－IFN－αand 5－FU treatment as a postoperative adjuvant following surgery forhepatocellular carcinoma with portal venous tumor thrombus［J］.Exp Ther Med，2013，5（1）：3－10.

［3］ Yamanaka C，Wada H，Hama N，et al.A case of advanced hepatocellular carcinoma with inferior vena cava tumor thrombus and multiple intrahepatic metastases treated successfully by transcatheter arterial chemoembolization and radical hepatectomy［J］.Gan To Kagaku Ryoho，2012，39（12）：1819－1821.

［4］ 楊占鳳，倪克梁，林萬隆，等.圍介入手術(shù)期聯(lián)合應(yīng)用IFN－α及ATRA治療肝癌的機(jī)制探討［J］.中華肝膽外科雜志，2010，16（4）：295－299.

［5］ 李濤，智緒亭，周建煒，等.小劑量阿司匹林協(xié)同干擾素－α抑制肝細(xì)胞肝癌生長轉(zhuǎn)移的實驗研究［J］.中華肝膽外科雜志，2012，18（1）：50－53.

［6］ 全毅，劉建剛，蔡悅成，等.經(jīng)肝動脈化療栓塞聯(lián)合腫瘤間質(zhì)治療肝癌臨床研究［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2010，39（8）：924－926.

［7］ 劉子文，劉長征，劉衛(wèi)，等.全反式維甲酸抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制研究［J］.中華肝膽外科雜志，2012，18（5）：386－388.

［8］ 林尤仕，朱明月，周升，等.甲胎蛋白調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體2表達(dá)及其對Bel 7402細(xì)胞耐受該配體的影響［J］.中華肝臟病雜志，2010，18（10）：745－750.

［9］ Kalathil S，Lugade AA，Miller A，et al.Higher frequencies of GARP＋CTLA－4＋Foxp3＋ T regulatory cells and myeloid－derived suppressor cells in hepatocellular carcinoma patients are associated with impaired T－Cell functionality［J］.Cancer Res，2013，73（8）：2435－2444.

［10］Kusano H，Ogasawara S，Akiba J，et al.Antiproliferative effects of sorafenib and pegylated IFNα2bon human liver cancer cells in vitro and in vivo［J］.Int J Oncol，2013，42（6）：1897－1903.

［11］董兆如，李濤，曲思鳳，等.小劑量阿司匹林協(xié)同干擾素－α誘導(dǎo)肝癌BEL－7402細(xì)胞凋亡的實驗研究［J］.中華肝膽外科雜志，2012，18（4）：292－295.

［12］Zhu AX，Ancukiewicz M，Supko JG，et al.Efficacy，safety，pharmacokinetics，and biomarkers of cediranib monotherapy in advancedhepatocellular carcinoma：aphase Ⅱstudy［J］.Clin Cancer Res，2013，19（6）：1557－1566.

［13］Lee YJ，Kim GH，Park do Y，et al.A case of epidural abscess occurred after liver abscess complicated by transarterial chemoembolization in a patient with metastatic cancer to liver［J］.Korean J Gastroenterol，2013，61（4）：225－229.

［14］Cui YL，Li HK，Zhou HY，et al.Correlations of Tumorassociated Macrophage Subtypes with Liver Metastases of Colorectal Cancer［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2013，14（2）：1003－1007.

［15］Koneri K，Hirono Y，F(xiàn)ujimoto D，et al.Five－year survival of alpha－fetoprotein－producing gastric cancer with synchronous liver metastasis：a case report［J］.J Gastric Cancer，2013，13（1）：58－64.