LRP16基因在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)及其對細(xì)胞增殖的作用＊

張宇驕，劉 玲，汪春燕，詹 平，伍宗惠，何 雯，王定玉

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川瀘州646000）

子宮內(nèi)膜癌為女性生殖系統(tǒng)常見三大惡性腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%。子宮內(nèi)膜癌早期診斷和治療預(yù)后較好，但一旦轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，5年生存率降低70%。不典型增生使癌變的風(fēng)險(xiǎn)較高，但單純性增生和復(fù)雜性增生發(fā)生癌變的風(fēng)險(xiǎn)低，子宮內(nèi)膜癌可能存在誤診或治療過度的傾向［1］，因此尋找新的預(yù)測風(fēng)險(xiǎn)的腫瘤標(biāo)記物是診治研究的重點(diǎn)。LRP16基因在雌激素相關(guān)腫瘤中表達(dá)升高，其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切的聯(lián)系。本研究應(yīng)用WST－1法、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）技術(shù)等來探討子宮內(nèi)膜癌組織和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC－1－B細(xì)胞中LRP16表達(dá)的變化及其在細(xì)胞增殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2008年10月至2010年3月在本科室進(jìn)行手術(shù)治療的子宮內(nèi)膜癌患者的組織標(biāo)本26例。26例內(nèi)膜癌組織病理診斷為高分化腺癌10例，中分化腺癌10例，低分化腺癌6例，其中雌激素受體（ER）陽性患者19例，ER陰性患者

7例；根據(jù)2009FIGO子宮內(nèi)膜癌手術(shù)病理分期Ⅰ期19例，Ⅱ期3例，Ⅲ期3例，Ⅳ期1例。另取同期良性疾?。ㄗ訉m肌瘤或子宮腺肌瘤）手術(shù)患者的正常子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本10例作為對照，患者平均年齡為51歲。所有患者術(shù)前均未接受放、化療。

1.2 試劑 實(shí)驗(yàn)所用LRP16真核表達(dá)載體EX－Y2069－M29、空質(zhì)粒EX－NEG－M29由本實(shí)驗(yàn)組構(gòu)建。人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC－1－B購自上海中科院細(xì)胞庫。RNA提取試劑盒及RTPCR試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品，PCR引物由上海生物工程公司合成，WST－1細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒為碧云天公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 LRP16mRNA表達(dá)的檢測 采用Invitrogen公司的Trizol反應(yīng)試劑盒提取正常子宮內(nèi)膜組織及子宮內(nèi)膜癌組織總的RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以LRP16和β－action（作為內(nèi)參照）引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，最后進(jìn)行PCR產(chǎn)物的定性檢測。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)、基因轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染克隆的篩選 HEC－1－B細(xì)胞用含10% 小牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基在5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、EX－Y2069－M29組、EX－NEG－M29組。第1組中加入無質(zhì)粒的脂質(zhì)體稀釋液，第2組中加入70μL EX－Y2069－M29－Opti－Lipofecter復(fù)合物，第3組中加入70μL EX－NEG－M29－Opti－Lipofecter復(fù)合物，輕輕混勻，置37℃5%CO2的孵箱培養(yǎng)，5h后換成無雙抗新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48h后，3組細(xì)胞同時加入濃度為400μg／mL的G418選擇培養(yǎng)液進(jìn)行篩選，每3天換液1次，篩選抗G418克隆，挑選陽性克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)。快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染：將HEC－1－B細(xì)胞接種于24孔板，在轉(zhuǎn)染48h后用RT－PCR法檢測LRP16基因的表達(dá)。

1.3.3 轉(zhuǎn)染克隆的鑒定 收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，采 用 RT－PCR 法 檢 測 HEC－1－B 細(xì) 胞 LRP16 基 因 的表達(dá)。

1.3.4 細(xì)胞生長曲線的繪制 收獲對數(shù)生長期的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染HEC－1－B細(xì)胞，每孔2×104個細(xì)胞接種于6孔板中，次日開始每天計(jì)數(shù)各組的細(xì)胞數(shù)量，連續(xù)計(jì)數(shù)7d，繪制生長曲線。

1.3.5 WST－1檢測細(xì)胞增殖 收集對數(shù)生長期的未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染HEC－1－B細(xì)胞，每孔6×104個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞融合率達(dá)到70%～80%時，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)設(shè)3組即：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組 HEC－1－B細(xì)胞，每組5個復(fù)孔。向每孔中各加入10μL 5mg／mL WST－1液，37℃5%CO2飽和濕度下孵育5h，分別在第24、48、72小時用酶標(biāo)儀測定450nm波長時每孔的光密度（OD）值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 LRP16mRNA在子宮內(nèi)膜癌、正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá) 26例子宮內(nèi)膜癌組織中有21例LRP16mRNA陽性（83.33%），LRP16mRNA的平均表達(dá)水平為0.82±0.21；10例子宮內(nèi)膜組織中有3例LRP16mRNA陽性（30.00%），LRP16 mRNA的平均表達(dá)水平為0.47±0.18；LRP16mRNA的陽性表達(dá)率及表達(dá)水平分別比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 基因轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染克隆的篩選與鑒定 HEC－1－B細(xì)胞在G418篩選培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)1個月后，未轉(zhuǎn)染的HEC－1－B細(xì)胞全部死亡。維持選擇培養(yǎng)2周時，實(shí)驗(yàn)組和空載體組分別獲得抗G418克隆，大量擴(kuò)增抗性細(xì)胞，并傳代培養(yǎng)，分別命名為EX－Y2069－M29（轉(zhuǎn)染LRP16cDNA）和EX－NEG－M29（轉(zhuǎn)染空載體）。RT－PCR法檢測顯示，未轉(zhuǎn)染組及EX－NEG－M29組和EX－Y2069－M29組的 HEC－1－B細(xì)胞均有LRP16基因表達(dá)，未轉(zhuǎn)染組和 EX－NEG－M29組的表達(dá)量分別為0.123 1±0.036 6、0.148 6±0.028 7，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；EX－Y2069－M29組表達(dá)量為0.506 0±0.019 8，未轉(zhuǎn)染組、EX－NEG－M29組、EX－Y2069－M29組三者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），EX－Y2069－M29組表達(dá)明顯增高，見圖1。

圖1 RT－PCR產(chǎn)物凝膠電泳

2.3 LRP16對HEC－1－B細(xì)胞增殖的影響 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖速度明顯低于非轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的生長速率低于對照組未轉(zhuǎn)染HEC－1－B細(xì)胞；自轉(zhuǎn)染的24h起，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長明顯低于未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，增殖明顯減慢（圖2）。WST－1法檢測結(jié)果顯示LRP16轉(zhuǎn)染組較陰性對照組、空載體轉(zhuǎn)染組任意一組間HEC－1－B細(xì)胞OD值低（P＜0.05）；陰性對照組和空載體轉(zhuǎn)染組OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

圖2 HEC－1－B細(xì)胞的生長曲線

表1 各組細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的OD（A450）值（±s）

表1 各組細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的OD（A450）值（±s）

時間 陰性對照組 空質(zhì)粒組 LRP16組24h0.349 3±0.019 9 0.339 0±0.015 9 0.349 3±0.013 9 48h0.590 0±0.029 6 0.586 0±0.011 1 0.425 7±0.021 4 72h0.806 0±0.045 6 0.840 3±0.022 7 0.575 0±0.019 0 96h0.971 3±0.025 0 0.957 3±0.022 4 0.636 7±0.011 1

3 討 論

在既往對細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)人體各種組織細(xì)胞內(nèi)均有不同程度的LRP16表達(dá)，該基因在人類多種腫瘤細(xì)胞如乳腺癌等中的表達(dá)量明顯高于其正常對應(yīng)組織，尤其是在雌激素依賴性的腫瘤中表達(dá)量增高更明顯，而在已公認(rèn)的與雌激素?zé)o關(guān)的腫瘤中和雌激素受體陰性的腫瘤中，LRP16基因的表達(dá)低，LRP16的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系［2－3］。研究表明，LRP16是雌激素反應(yīng)性識別靶基因，雌激素誘導(dǎo)LRP16的表達(dá)上調(diào)，具體調(diào)控途徑由ERa介導(dǎo)［4］。在細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)，ERa陽性乳腺癌細(xì)胞和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中LRP16的表達(dá)水平依賴于雌激素活性；過表達(dá)的LRP16通過增強(qiáng)雌激素激活ERa功能從而促進(jìn)人乳腺癌 MCF－7細(xì)胞的增殖，抑制LRP16基因的表達(dá)通過上調(diào)ERa介導(dǎo)的E－cadherin表達(dá)從而抑制雌激素反應(yīng)性乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲能力［5－6］。Han等［5］觀察到乳腺癌 MCF－7細(xì)胞 LRP16表達(dá)下調(diào)后，雌激素并沒有促進(jìn)細(xì)胞的生長，下調(diào)LRP16破壞了雌激素刺激細(xì)胞生長的作用。此外，LRP16mRNA的表達(dá)水平與乳腺癌的病理分級呈正相關(guān)［7］。由此表明，LRP16在致癌過程中起著重要的作用，通過激活ERa調(diào)控激素依賴性腫瘤的進(jìn)展。大量研究表明，ERa與雌激素依賴性腫瘤的治療及預(yù)后判斷密切相關(guān)，LRP16與ERa之間存在表達(dá)調(diào)控與反饋激活的作用，所以檢測腫瘤中LRP16的表達(dá)水平具備了反映ERa信號活性的良好特征，鑒于LRP16蛋白的功能特征，檢測雌激素相關(guān)腫瘤中LRP16的表達(dá)應(yīng)優(yōu)于檢測腫瘤中ERa本身的含量及其目前臨床上使用的任何一個靶蛋白的水平。作為激素相關(guān)的惡性腫瘤的診斷及預(yù)后判斷指標(biāo)，LRP16可能成為反映該類腫瘤預(yù)后標(biāo)志物，進(jìn)一步探索LRP16和ER相互作用的分子生物學(xué)機(jī)制，以及ER調(diào)控下游基因的機(jī)制和通路，為進(jìn)一步探索該類腫瘤形成和進(jìn)展機(jī)制創(chuàng)造了條件。

該研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織中LRP16mRNA的陽性表達(dá)率及表達(dá)水平均高于正常子宮內(nèi)膜組織，由此推測LRP16與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系，參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展過程，同既往的研究結(jié)果相似，其可能成為子宮內(nèi)膜癌診斷和預(yù)后判斷的腫瘤標(biāo)記物。該研究發(fā)現(xiàn)，LRP16轉(zhuǎn)染組HEC－1－B細(xì)胞在體外能繼續(xù)增殖，說明利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染LRP16基因到子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC－1－B是安全可行的，并可使LRP16基因獲得穩(wěn)定表達(dá)，為下一步研究LRP16基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖情況的影響，探討LRP16基因的分子生物學(xué)機(jī)制及對子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展的影響打下基礎(chǔ)。但HEC－1－B細(xì)胞增殖能力明顯下降，由此可見，LRP16基因表達(dá)上調(diào)并沒有促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌HEC－1－B細(xì)胞的增殖，其可能通過增加HEC－1－B細(xì)胞的體外侵襲、生長能力參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展［8］，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。LRP16基因參與致癌過程，參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展過程，可望通過選擇性阻遏LRP16基因表達(dá)，抑制正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變，治愈子宮內(nèi)膜惡性腫瘤，從而為分子水平治愈激素相關(guān)性疾病開辟廣闊的治療前景。

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