多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌基因型檢測(cè)及其耐藥性分析

呂娜 劉仁淳 陳柳勤

鮑曼不動(dòng)桿菌的分離率及耐藥性較高，是臨床多種感染的主要誘發(fā)菌種。由于近些年來抗生素的濫用問題，造成鮑曼不動(dòng)桿菌的多重耐藥性，影響臨床的施治與用藥[1]。多重耐藥性細(xì)菌目前已經(jīng)成為世界醫(yī)學(xué)界共同面臨的難題之一[2]，泛耐藥性細(xì)菌感染甚至可能將患者置于無藥可救的境地。因此研究多重耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌的基因型和耐藥性具有重要意義，可有效指導(dǎo)臨床治療的具體用藥方法和劑量，為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 選取東莞市長(zhǎng)安醫(yī)院2011年1-12月間住院患者的血液、尿液、痰液、分泌物等樣本進(jìn)行分離，并獲得多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌共20株（無重復(fù)株）作為研究對(duì)象。樣本來源：腦外科8例，神經(jīng)科3例，呼吸科5例，骨科1例，皮膚科2例，普外科1例。采用銅綠假單胞菌（ATCC27853）和大腸埃希菌（ATCC25922）作為標(biāo)準(zhǔn)菌株，由廣東省臨床檢驗(yàn)中心提供。

1.2 細(xì)菌鑒定 采用法國(guó)生物梅里埃公司提供的ATB微生物鑒定儀和配套的ID鑒定卡進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

1.3 儀器和試劑 MH瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自江門凱林生物工程有限公司，藥敏紙片由英國(guó)Oxoid生物公司提供，PCR聚合酶鏈反應(yīng)儀由美國(guó)ABI公司生產(chǎn)，電泳儀由創(chuàng)博環(huán)球（北京）生物科技有限公司提供，凝膠成像系統(tǒng)是英國(guó)UVI公司產(chǎn)品，Premix Taq酶購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，DL 2000 DNA Maker購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.4 藥敏試驗(yàn) 采用瓊脂擴(kuò)散法（K-B法）進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，對(duì)研究菌株耐藥性進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)參照CLSI2011提出的相關(guān)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)[3]。

1.5 PCR模板 選用對(duì)亞胺培南敏感性弱的鮑曼不動(dòng)桿菌菌株利用煮沸法進(jìn)行PCR模板的制備，菌株常規(guī)接種于血平皿上，待24h后挑選出一些菌落轉(zhuǎn)置到EP管，150μL滅菌蒸餾水加入EP管，共同煮沸10min，再迅速冷卻至4℃。所得溶液以12000轉(zhuǎn)進(jìn)行分離處理，5min后取上清液建立PCR模板，保存于－20℃環(huán)境下備用。

1.6 PCR擴(kuò)增 采用PCR法對(duì)OXA基因進(jìn)行檢測(cè)，分別加入Premix Taq酶和上下游引物，以ddH2O補(bǔ)足達(dá)50μL后，于94℃行5min預(yù)變性和45s變性，再轉(zhuǎn)置52℃行45s退火，轉(zhuǎn)置72℃行延伸1min，循環(huán)處理，共35次，末次處理于72℃延伸至10min。獲得PCR產(chǎn)物取出5μL，以濃度1.5%的瓊脂糖凝膠電泳處理后進(jìn)行分析。

1.7 DNA序列 PCR產(chǎn)物送達(dá)上海英駿生物技術(shù)有限公司，實(shí)施進(jìn)一步的純化和雙向測(cè)序，并于網(wǎng)上進(jìn)行同源比對(duì)分析，確定菌種基因型。

2 結(jié)果

2.1 耐藥性 20株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)常見的10抗菌藥物敏感率及耐藥率分布情況見表1，亞胺培南、頭孢曲松耐藥率可達(dá)98%，其余6種抗生素耐藥率均超出或等于80%，按耐藥率由高到低排序?yàn)椋侯^孢他啶、環(huán)丙沙星、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢吡肟、慶大霉素、復(fù)方新諾明、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素；按敏感性由低至高排序：亞胺培南、頭孢曲松、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明。

表1 20株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)10種抗生素的敏感性試驗(yàn)結(jié)果比較

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果 20株鮑曼不動(dòng)桿菌中，17株（85%）經(jīng)OXA-23擴(kuò)增為陽(yáng)性，其與GQ849192序列號(hào)的鮑曼不動(dòng)桿菌同源；14株（70%）經(jīng)OXA-51擴(kuò)增為陽(yáng)性，與GQ525851序列號(hào)的鮑曼不動(dòng)桿菌同源。

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌是一種非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，廣泛存在于自然界、醫(yī)院環(huán)境及人體皮膚、粘膜、呼吸道和泌尿生殖道中，常引起住院患者呼吸道感染、菌血癥、中耳炎、泌尿系和傷口感染等。該菌對(duì)多數(shù)常用抗菌藥耐藥率高，具有多重耐藥性目前已被證實(shí)[4-5]，在臨床分離的非發(fā)酵菌中僅次于銅綠假單胞菌，是引起醫(yī)院感染的重要病原菌之一，故而了解該菌種的耐藥性及基因型對(duì)于有效指導(dǎo)臨床給藥和療效觀察具有重要意義。

在本組研究中，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南等大量碳青霉菌烯類抗生素的耐藥性及高，尤其對(duì)本組研究的8種用藥耐藥性均達(dá)到80%以上，這也提示了鮑曼不動(dòng)桿菌同時(shí)對(duì)其它廣譜抗菌類藥物存在較高的耐藥性。耐藥性的出現(xiàn)與臨床濫用藥物有關(guān)，也與患者自身的機(jī)體特征有關(guān)。鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制包括染色體基因突變、外膜孔蛋白改變、藥物主動(dòng)外排系統(tǒng)和產(chǎn)生滅活酶等，其耐藥基因可通過接合性質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合型噬菌體、整合子的水平傳遞等發(fā)生擴(kuò)散[6]。上述原因使得鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生交叉耐藥，出現(xiàn)多重耐藥菌且傳播迅速。但鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥的耐藥機(jī)制，目前尚不十分明確。根據(jù)本組對(duì)基因型的研究，本研究收集的鮑曼不動(dòng)桿菌與OXA-23和51有相互作用，提示鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性產(chǎn)生可能與易產(chǎn)生OXA-23和51的碳青霉烯類酶有關(guān)。

總之，鮑曼不動(dòng)桿菌的多重耐藥性已經(jīng)成為臨床治療的棘手問題，醫(yī)生在用藥時(shí)一方面要注意了解鮑曼不動(dòng)桿菌的高耐藥性藥品，以避免用藥不當(dāng)，另一方面仍需更多的相關(guān)研究明確對(duì)碳青霉烯類抗菌藥耐藥機(jī)制，以便于尋找更有利于臨床抑菌殺菌治療的有效藥品。

[1]陳濤，高燕渝.泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌引起醫(yī)院感染情況研究[J].基層醫(yī)學(xué)論壇，2012，16（7）：2464-2465.

[2]趙穎瑩，崔金環(huán).鮑曼不動(dòng)肝菌對(duì)青霉烯類抗生素的耐藥性及其基因的分析[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2012，40（3）：26-28.

[3]鄧思健，伍曉峰，鐘海波，等.多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株的主動(dòng)外排泵編碼基因檢測(cè)及分析[J].新醫(yī)學(xué)，2011，42（9）：608-610.

[4]王衛(wèi)華，陳潔，毛雄英，等.泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌獲得性耐藥基因和可移動(dòng)遺傳元件檢測(cè)與指標(biāo)聚類分析[J].中華臨床感染病雜志，2012，5（1）：9-11.

[5]佘婷婷，沈繼錄，徐元宏，等.廣泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐碳青霉烯類抗生素膜蛋白機(jī)制研究[J].中國(guó)感染與化療雜志，2012，12（4）：280-282.

[6]李小霞.鮑曼不動(dòng)桿菌的醫(yī)院感染調(diào)查和耐藥性分析[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，31（9）：1009-1010.