生物檢測及分子診斷高端裝備的研制及應用

彭年才，李 磊，李 政，苗保剛，李 明，趙 垚，蔣莊德

（1.西安交通大學機械工程學院，西安 710049；2.西安交通大學機械制造系統(tǒng)工程國家重點實驗室，西安 710049；3.西安天隆科技有限公司，西安 710049）

1 前言

生物檢測是指以現(xiàn)代生命科學應用為需求牽引，以先進制造和儀器科學技術(shù)為手段研制檢測儀器，結(jié)合各種測試技術(shù)、分析技術(shù)和其他基礎(chǔ)學科的科學原理，對生物的個體、器官、組織、細胞和生物大分子的生命活動進行定性、定量的觀察，比較，分析和判斷。而醫(yī)學診斷方法幾百年來至21世紀已經(jīng)經(jīng)歷了從常規(guī)尿液和血液檢測、體液酶分析、放射及酶聯(lián)反應分析到基于分子生物學進行分子診斷的歷程。

在世界范圍內(nèi)，隨著經(jīng)濟社會的飛速發(fā)展，人們對自身健康的要求需要實現(xiàn)高水平的疾病診斷技術(shù)?？茖W研究證明，基因可以揭示疾病的本質(zhì)，人類幾乎所有的疾病都直接或間接地與基因有關(guān)。人類可以從基因的發(fā)展水平上去認識和診斷疾病，并最終在基因水平上治療和預防疾病。在肝炎、流感、新型類嚴重急性呼吸綜合征（SARS）冠狀病毒病例、腫瘤等重大疾病和新發(fā)傳染病預警診斷和生物醫(yī)學科研中，生物檢測及分子診斷技術(shù)已經(jīng)得到了實際應用，并且發(fā)展前景廣闊。筆者研究團隊在生物檢測與基因分析設(shè)備相關(guān)理論研究、關(guān)鍵部件研制和工程化實踐方面，同時面向科學研究和市場需求，突破核心瓶頸技術(shù)，最終形成具有自主知識產(chǎn)權(quán)的高端分子診斷儀器，并通過工程化技術(shù)進行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，形成市場競爭力，并推廣應用于社會多個重要領(lǐng)域，降低對國外先進設(shè)備的依存度，促進經(jīng)濟社會發(fā)展。

2 典型的生物檢測系統(tǒng)——實時熒光定量PCR核酸檢測儀

2.1 研究背景

聚合酶鏈式反應（PCR）核酸檢測技術(shù)泛指以擴增DNA或RNA為手段，從而篩查特定基因的檢測技術(shù)，主要是針對聚合酶鏈反應產(chǎn)物的檢測技術(shù)。與傳統(tǒng)的生化檢測、免疫學檢測等生物檢測相比，PCR技術(shù)由于其在分子水平上進行檢測，是典型的分子診斷技術(shù)，而且引入了PCR熱循環(huán)和基因體外擴增的高靈敏性特征，使得其能對病原體或特定基因進行高效、特異性擴增和檢測。免疫學方法要等產(chǎn)生抗體才能檢出，相比之下，PCR核酸檢測技術(shù)大大縮短了檢出窗口期，一旦感染便能檢出，為疾病診斷贏得了時間，真正實現(xiàn)早診斷、早治療，降低了病死率[1]。

實時熒光定量PCR儀器又在傳統(tǒng)單一功能的PCR熱循環(huán)基因擴增儀的基礎(chǔ)上進行了理論和技術(shù)突破，使PCR熱循環(huán)基因擴增、多通道生物分子熒光檢測和核酸定量分析完全一體化，實現(xiàn)了PCR從定性檢測到定量檢測的飛躍[2，3]，更重要的是自動化檢測過程避免了定性PCR儀后續(xù)電泳檢測對生物標本開蓋暴露引起的生物污染風險。2008年夏季版的Drug Discovery World在題為“Emerging realtime PCR applications”的文章中指出：“隨著創(chuàng)新元素的加入，實時定量PCR儀器技術(shù)正在不斷發(fā)展，和10年前初入商業(yè)市場引起的轟動一樣，現(xiàn)今實時PCR的應用脫穎而出，它在科學研究和臨床診斷領(lǐng)域已經(jīng)成為核酸檢測主要和核心的技術(shù)平臺[4]?！?/p>

由于幾乎全部依賴進口，目前實時熒光定量PCR儀的價格昂貴，幾乎是普通PCR儀的10倍，并且讓我國重大疾病防控陷入被動，因此筆者研究團隊開發(fā)的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的國產(chǎn)新型實時熒光定量PCR儀滿足了國家急需。

2.2 關(guān)鍵技術(shù)研究

研發(fā)的實時熒光定量PCR核酸檢測儀器實物及系統(tǒng)總體框圖如圖1所示，包括多路溫控熱循環(huán)、熒光檢測和基因分析軟件三大模塊。創(chuàng)新點和克服的技術(shù)難點包括基于光開關(guān)的快速多路熒光檢測技術(shù)和基因定量分析技術(shù)。

2.3 基于光開關(guān)的快速多路熒光檢測

實時熒光定量PCR儀熒光檢測系統(tǒng)的任務是實現(xiàn)多通道熒光檢測和熒光定量，要求熒光采集既要速度快又要保證極高的靈敏度、信噪比及抗干擾性。進行通道之間信號快速切換和實現(xiàn)多孔不同標本微弱熒光快速激發(fā)與檢測、分析是實時熒光定量PCR儀的一個難點。現(xiàn)行的實時PCR技術(shù)電荷耦合元件（CCD）檢測方式靈敏度偏低，而機械掃描+光電倍增管（PMT）檢測方式速度慢[5，6]。這里采用一種基于光開關(guān)+PMT的實時PCR熒光檢測方案，巧妙克服了這兩種缺點。

圖1 實時熒光定量PCR核酸檢測儀實物及系統(tǒng)關(guān)鍵模塊組成框圖Fig.1 Physical map and system diagram of real-time fluorescent quantitative PCR instrument

基于光開關(guān)的PCR高通量熒光檢測系統(tǒng)框圖如圖2所示，框圖中采用新型器件光開關(guān)[7]與PMT[8]的組合設(shè)計實現(xiàn)快速多通道熒光信號切換，輔以抗干擾、解決光學邊緣效應、優(yōu)化軟件補償?shù)瓤茖W措施，提高了熒光檢測系統(tǒng)信噪比，有效解決了生物熒光檢測系統(tǒng)實現(xiàn)既高靈敏又高速高同步檢測的難點。通過電控裝置快速變換地址，即可通過入射光開關(guān)陣列和出射光開關(guān)陣列快速光掃描很快完成多個標本的定量基因檢測。由于采用自主發(fā)明專利，保證了多路檢測的快速性，能在0.96 s內(nèi)完成96孔樣本掃描，比進口MX3000P用3.5 s進行機械掃描要快得多，與CCD檢測方式相比，又保證了PMT檢測的高靈敏性以及無機械動作的可靠性。

圖2 基于光開關(guān)的PCR高通量熒光快速檢測系統(tǒng)示意圖Fig.2 Block diagram of PCR detection system overalldesign based on the optical switch

2.4 DNA定量分析算法

實時熒光定量PCR就是通過對PCR擴增反應中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測，從而實現(xiàn)對DNA/RNA起始模板定量及定性的分析。循環(huán)擴增過程中實際檢測到的擴增反應熒光值曲線不為指數(shù)，并且反應曲線跟樣品的濃度和效率相關(guān)。但在熒光信號指數(shù)擴增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇對這個階段的實際熒光值進行曲線擬合，然后進行CT值的計算。

通過分析PCR熒光數(shù)據(jù)特點，設(shè)計一種基于改進基因-文化算法的雙S曲線擬合算法。通過構(gòu)建遺傳算子，優(yōu)化算法參數(shù)，對原始熒光曲線進行濾波分類識別和標準曲線擬合分析，提高檢測結(jié)果的可靠性，并在此基礎(chǔ)上設(shè)計出一套基因擴增定量分析系統(tǒng)，通過基線自動識別和熒光曲線標準化處理，實現(xiàn)PCR擴增結(jié)果實時定量。建立基于標準曲線的數(shù)據(jù)分析模型，準確地擬合PCR擴增實驗的擴增曲線，根據(jù)擴增曲線分析獲得實時定量PCR關(guān)鍵的CT值，并得到準確的病毒、細菌等病原體初始擴增模板DNA含量。實現(xiàn)DNA/RNA高靈敏、寬線性范圍的熒光定量數(shù)據(jù)分析，確診疾病（見圖3）。

圖3 熒光分析實現(xiàn)病毒/細菌DNA/RNA高靈敏、寬線性范圍檢測和分子診斷從而確診疾病Fig.3 Fluorescence analysis to realize virus/bacterial DNA/RNA high sensitivity and wide linear range detection so as to diagnose diseases

2.5 儀器工程化技術(shù)、檢測性能的驗證

走校企結(jié)合的自主創(chuàng)新途徑，通過制定工程技術(shù)方案和質(zhì)量控制體系對研發(fā)的儀器質(zhì)量和性能進行保障。按照從可行性到產(chǎn)品退役的整個生命周期對產(chǎn)品進行分析，規(guī)范研發(fā)流程管理，采用集成產(chǎn)品開發(fā)（IPD）模式。在儀器開發(fā)和應用各環(huán)節(jié)與整機開發(fā)的銜接方面，按照ISO13485質(zhì)量體系規(guī)范相關(guān)內(nèi)容，制定控制體系，建立針對儀器特點行之有效的可靠性和安全性設(shè)計、評價及相關(guān)控制流程方法的綜合體系。

研發(fā)的實時熒光定量PCR儀通過產(chǎn)學研用模式已經(jīng)獲得了國家發(fā)明專利和醫(yī)療器械注冊證，實現(xiàn)了批量化生產(chǎn)，該儀器經(jīng)過了國家食品藥品監(jiān)督管理局天津醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢測中心的檢測，及第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院和西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院國家藥物臨床研究機構(gòu)的臨床驗證和省級科技鑒定。該儀器可檢測96個0.2 mL PCR反應管，溫控準確度：0.3 °C，平均升溫速度：2.6 °C/s，平均降溫速度：2.4 °C/s，控溫范圍：4～99 °C，DNA/RNA定量精度：CT值的相關(guān)系數(shù)R=0.997；CT值的重復性誤差CV=2.1%。與國外進口的標志性品牌ABI公司的7700型儀器相比，以上指標如平均升、降溫速度和控溫精度等明顯高于進口品牌。而包括一體機多通道、自動化水平、多色檢測以及熱蓋功能等指標與國外產(chǎn)品相當，總體達到了國際先進水平。

2.6 在社會發(fā)展重點領(lǐng)域中的應用

多個國際、國家或行業(yè)標準將實時定量PCR規(guī)定為病原體檢測、突發(fā)傳染病診斷、生物污染和疫情監(jiān)測的依據(jù)[9]，如2009年世界衛(wèi)生組織、美國疾病控制與預防中心（CDC）以及中國衛(wèi)生部把實時定量PCR方法確定為檢測病毒核酸、確診甲型H1N1流感的實驗室確診方法。研發(fā)的國產(chǎn)實時熒光定量PCR儀能夠滿足上述需求，已應用到全國多家各級各類醫(yī)療及疾控部門，服務于肝炎、流感、艾滋病及優(yōu)生優(yōu)育檢測，替代進口。在2009年流感爆發(fā)期間，裝備了近10家國家流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室，在西安市疾病預防控制中心檢出了陜西省首例甲型H1N1流感病例[10]，并得到了國家疾病預防控制中心的復核確認，另外在全國流感檢測中得到了推廣。圖4為檢出陜西首例甲型H1N1流感時的分子診斷曲線圖，完成檢測耗時2 h 10 min，陽性對照、陰性對照、內(nèi)對照、被測未知標本CT值偏差及特異性和敏感性等指標均達到了甲型H1N1核酸檢測試驗的要求。

圖4 應用實時熒光定量PCR核酸檢測儀檢測甲型H1N1流感病毒結(jié)果Fig.4 Application of real-time fluorescent quantitative PCR nucleic acid detector testing a H1N1 flu virus

作為科學研究儀器，研發(fā)的實時熒光定量PCR儀同樣廣泛應用于全國各科研院所，服務于多項生物醫(yī)學前沿研究工作，滿足了核酸定量檢測及基因分析等科研重大需求。如西安交通大學醫(yī)學院生理與病理生理學系通過使用核酸提取儀及實時熒光定量PCR儀進行不同樣本來源的核酸提取，用于帕金森、冠狀動脈硬化和癌癥的分子病理學研究；西北農(nóng)林科技大學生命科學學院利用實時熒光定量PCR儀進行人乳頭瘤病毒（HPV）宮頸癌相關(guān)基因組學研究。復旦大學使用研發(fā)的PCR分子診斷儀進行腦神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)基因研究，在腦病理學權(quán)威期刊發(fā)表了影響因子為8.654的高水平論文[11]。

通過實時熒光定量PCR在以上各領(lǐng)域的應用，推動了量大、面廣、價高的高端分子診斷裝備和生命科學儀器的技術(shù)突破和自我裝備能力，促進了我國生命科學相關(guān)研究的發(fā)展，提升了我國科學儀器和先進裝備制造的產(chǎn)業(yè)化水平和國際競爭力，因此實時熒光定量PCR儀成果被選入“十一五”國家重大科技成就展。

3 生物檢測與分子診斷裝備發(fā)展

3.1 微型化、便攜化方向滿足現(xiàn)場快速檢測需求

進入21世紀以來，飛速發(fā)展的經(jīng)濟社會及日益增長的全球市場對高端生物檢測與分子診斷裝備提出了更高的要求，針對檢測儀器微型化、現(xiàn)場化和即時檢測（POCT）的應用需求，筆者研究團隊研發(fā)了適用于現(xiàn)場快速檢測細菌總量的微小型便攜化生物檢測設(shè)備——手持式腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）生物發(fā)光法細菌快速檢測儀[12，13]。其儀器及快速檢測微反應腔設(shè)計示意如圖5所示。

圖5 手持式ATP細菌快速檢測儀器與微反應腔設(shè)計示意圖Fig.5 Schematic diagram of hand-held ATP bacteria rapid detector machine and design of micro reaction cavity

ATP又叫三磷酸腺苷，是所有生物包括細菌的細胞中均有的能量分子。測定出樣品中細菌細胞的ATP含量，即可得知細菌數(shù)。ATP試劑中熒光素-熒光素酶等與被測樣本反應能產(chǎn)生光子，如式（1）所示。由于細菌總量與發(fā)光值之間存在一定的函數(shù)關(guān)系，因此通過檢測發(fā)光值即能得到被測樣本所含細菌等微生物總量，該方法具有廣普、靈敏度高和速度快的優(yōu)點。

微生物發(fā)光有以下特點：微弱、短暫、穩(wěn)定性差、發(fā)光曲線呈類拋物線型及信號易被淹沒。筆者研究團隊采用一種使用酶促擴大低水平ATP的ATP循環(huán)系統(tǒng)[14]，如圖6所示。基于微流控芯片的多酶ATP信號放大技術(shù)將微流控芯片設(shè)計成一定周期的兩種酶交替排放，就能形成一定的放大倍數(shù)，這樣流道出口放大后的ATP濃度取決于流道入口ATP的初始濃度，只要恰當?shù)乜刂苾煞N酶的活性、量及反應時間，則可以在一定程度上維持放大倍數(shù)不變，再通過對ATP生物熒光檢測確定微生物總量。

圖6 酶促擴大ATP的循環(huán)系統(tǒng)示意圖Fig.6 Schematic diagram of enzymatic expanded ATP circulation system

細菌菌落總數(shù)是國際上食品衛(wèi)生標準中判斷食品衛(wèi)生質(zhì)量的一項重要指標，也叫潔凈度指標。在醫(yī)院感染控制、食品藥品生產(chǎn)潔凈度及食品安全檢測和環(huán)保、生物污染評估等應用領(lǐng)域中，傳統(tǒng)的實驗室細菌培養(yǎng)法/平皿法評估細菌總量需24 h以上，且靈敏度低。筆者研究團隊研發(fā)的手持式ATP生物發(fā)光法細菌快速檢測儀僅需十幾秒鐘，且靈敏度達到食品檢測等領(lǐng)域的要求，發(fā)明專利“一種手持式三磷酸腺苷熒光檢測裝置”是國內(nèi)首個也是目前唯一手持式ATP熒光檢測系統(tǒng)相應的發(fā)明專利。美國多個專業(yè)權(quán)威機構(gòu)研究了1 000個以上的樣品，這種只需十幾秒就能完成檢測的快速檢測法所得實驗結(jié)果90%以上與24～48 h標準細菌培養(yǎng)法/平皿法所得結(jié)果一致。加拿大食品監(jiān)查協(xié)會經(jīng)過比對實驗后發(fā)現(xiàn)，本產(chǎn)品測定結(jié)果與標準培養(yǎng)法的相關(guān)性是98%[15]。本檢測儀測定結(jié)果與傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)法所得結(jié)果相比，相關(guān)性高達92%～98%，而且該儀器為便攜式設(shè)備，操作簡單，攜帶方便，可就地即時檢測樣品，整個過程1 min內(nèi)得出檢測結(jié)果。

該檢測儀器目前已進入批量化生產(chǎn)，并經(jīng)陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所檢驗，其性能達到和超出我國《縣級衛(wèi)生監(jiān)督機構(gòu)現(xiàn)場快速檢測設(shè)備裝備標準》及《餐飲服務食品安全現(xiàn)場快速檢測設(shè)備配備基本標準》的要求，用于食品加工、儲存運輸、貿(mào)易、餐飲服務以及醫(yī)療系統(tǒng)物體表面及操作人員手等表面潔凈度快速測定，尤其在食品和生物污染突發(fā)事件現(xiàn)場快速檢測中起到了不可替代的作用，已大規(guī)模推廣應用到陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所、山東魯藥集團、天津大學、北京三元食品有限公司、青島圣元乳業(yè)、甘肅省人民醫(yī)院、河南省食品藥品監(jiān)督管理局、韓國Teltron、加拿大M&I Instruments等單位，應用單位反饋證明滿足檢測需求。

3.2 自動化、集成化滿足大批量樣本處理需求

除了滿足微型化、現(xiàn)場化和即時檢測這一發(fā)展要求，高通量、大型、滿足樣本全自動檢測的需求也是生物檢測與分子診斷裝備發(fā)展的一個重要方向。目前的生物檢測設(shè)備如實時熒光定量PCR儀還須另外配備樣品和試劑等液體的前處理設(shè)備，總體檢測速度相對較慢，測定周期延長，對大樣本的批量處理能力較弱，樣本在前處理與后續(xù)檢測之間存在污染而導致檢測結(jié)果的準確性降低，因此在生物檢測與分子診斷領(lǐng)域迫切需要自動化和集成化的檢測儀器。

以自有專利技術(shù)為基礎(chǔ)，筆者研究團隊正在研發(fā)中的高通量核酸自動化定量檢測與高分辨分析系統(tǒng)，目標實現(xiàn)自動化樣本轉(zhuǎn)移和加樣，集核酸提取、基因擴增、定量檢測和高分辨分析4種功能為一體，開發(fā)出重大裝備，填補國內(nèi)空白。為實現(xiàn)核酸提取和PCR反應體系建立的自動化，重點研究自適應運動控制、運行過程監(jiān)控、智能化生物污染控制技術(shù)等，基于“壓控熱管恒溫槽”進行創(chuàng)新的熱循環(huán)模塊設(shè)計擬采用專利技術(shù)的集成溫度壓力傳感器提高溫控系統(tǒng)的性能，滿足高分辨率溶解曲線（HRM）分析對溫度均勻性、升降溫速度的要求。在分析軟件中，采用無需先驗知識的“free-form”特征提取算法進行HRM高分辨熔解曲線分析和“小世界神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)”的基因分型聚類分析算法，通過對熔解曲線的進一步形態(tài)分析及歸一化處理可得到更詳細、更精確的DNA信息，實現(xiàn)如甲基化或單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析等突變檢測和基因分型科學研究。

4 結(jié)語

隨著人類社會發(fā)展，醫(yī)學診斷、疾病控制、生物安全、食品安全、檢驗檢疫、農(nóng)林牧漁、生物學醫(yī)學研究等社會各領(lǐng)域都對生物檢測與分子診斷高端設(shè)備提出了更高的要求。筆者研究團隊通過產(chǎn)學研一體化的創(chuàng)新途徑，對儀器所涉交叉學科的研究探討和高端裝備研制關(guān)鍵技術(shù)的攻關(guān)，推動了量大、面廣、價高的高端分子診斷儀器裝備和生命科學儀器的技術(shù)突破和自我裝備能力，促進了我國生命科學相關(guān)研究的發(fā)展，提升了我國科學儀器和先進裝備制造的產(chǎn)業(yè)化水平和國際競爭力。面對新的發(fā)展需求，要緊跟前沿趨勢，融合先進的微納制造技術(shù)與自動化控制技術(shù)，實現(xiàn)分子診斷的即時檢驗和大通量生物樣本自動化檢測，使生物檢測與分子診斷高端設(shè)備更好地服務于社會生活。

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