中藥肝復(fù)康對四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝組織PⅠ3K/PKB信號(hào)通路和PDGFR-β表達(dá)的影響*

李 驄 周 情 姜妙娜 張彩華 賈玉杰

肝纖維化是各種原因所致的反復(fù)肝損傷在組織修復(fù)過程中的一種代償反應(yīng)，以細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的構(gòu)成改變和過度沉積為病理學(xué)特征。肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）激活引起以膠原為主的ECM各成分合成增多，降解相對不足，過多沉積在肝內(nèi)，引起肝纖維化[1～5]。血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）是目前已知多肽生長因子中對HSC作用最強(qiáng)的有絲分裂原，能夠通過不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路強(qiáng)烈刺激HSC增殖和遷移[6，7]，其中PI3K/PKB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在肝纖維化的發(fā)生中起著重要的作用[8]。該信號(hào)通路廣泛參與細(xì)胞的存活、分化和遷移，以及抗凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)等活動(dòng)[9～11]。中藥肝復(fù)康被證實(shí)對肝纖維化具有防治作用[12，13]。本研究探討了肝復(fù)康對四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝組織PI3K/PKB通路的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞 健康SD大鼠，雌雄不限，體重180～220克，清潔級，由本校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

二、藥物及含藥血清的制備 肝復(fù)康由柴胡、當(dāng)歸、黃芪、赤芍、白芍、丹參等組成，其無菌原液由本校中西醫(yī)結(jié)合研究所按既定的工藝制備（1.95g/ml）。將肝復(fù)康按 4.16ml/只分別給大鼠灌胃7次，每次間隔 24小時(shí)，在第7次灌胃后，行下腔靜脈取血，常規(guī)處理后即為藥物血清。對照組以生理鹽水代替藥物，制備方法同上。

三、肝纖維化動(dòng)物模型的制備 隨機(jī)將大鼠分為正常對照組、模型組和肝復(fù)康治療組。在造模時(shí)，皮下注射以橄欖油稀釋的10%四氯化碳5ml.kg-1，每周兩次，共12周。正常對照組以同樣方法皮下注射生理鹽水。其中肝復(fù)康治療組于造模第9周后開始用肝復(fù)康（溶于10ml/kg生理鹽水）312.5mg.kg-1.d-1灌胃至20周，而正常對照組和模型組則以等容量的生理鹽水灌胃。于21周末處死動(dòng)物，迅速取出肝組織，稱取肝臟濕重，部分用10%甲醛固定后制備石蠟切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察肝組織纖維化程度和炎癥活動(dòng)度，其余置-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

四、大鼠肝組織PDGF受體（R）-β表達(dá)的檢測 采用SP法，兔抗鼠PDGFR-β多克隆抗體（工作濃度1:200）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。二步法免疫組化檢測試劑PowerVision（PV-6001）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

五、肝組織PI3K和PKB1mRNA水平檢測 采用RT-PCR法，用Trizol試劑分別提取肝組織和HSCs總RNA，應(yīng)用Quant Reverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。以適量cDNA為模板，以β-actin為內(nèi)參照，PCR擴(kuò)增肝組織PI3K和PKB1基因片段。引物由華大基因研究中心合成。引物及PCR反應(yīng)條件詳見表1、2。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS 13.0軟件，所有數(shù)據(jù)均用±s表示，采用單因素方差分析，然后用LSD法進(jìn)行兩兩比較。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.01為有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 引物序列

表2 PCR反應(yīng)條件

結(jié)果

一、肝復(fù)康對大鼠肝組織PDGFR-β蛋白表達(dá)的影響 正常組大鼠肝組織PDGFR-β表達(dá)呈弱陽性，模型組大鼠可見肝組織細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞膜PDGFR-β陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，主要見于門靜脈、匯管區(qū)及纖維間隔等纖維化區(qū)域，在炎性細(xì)胞浸潤聚集區(qū)也有表達(dá)。與模型組比，治療組大鼠肝組織PDGFR-β陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少。根據(jù)陽性物質(zhì)光密度分析，模型組PDGFR-β的表達(dá)（0.386±0.04）顯著高于正常組（0.323±0.04），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；治療組 PDGFR-β 表達(dá)（0.340±0.01）較模型組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而治療組與正常對照組比，則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖1）。

圖1 大鼠肝組織PDGFR-β表達(dá)情況（SP法，100～400×）

二、肝復(fù)康對肝組織PI3K和PKB1mRNA水平的影響 在正常大鼠肝組織能檢測到低水平的PI3Km-RNA；模型組大鼠肝組織PI3KmRNA水平明顯上調(diào)，與正常組比有顯著性差異（P<0.01）；治療組大鼠肝組織PI3KmRNA水平較模型組明顯下調(diào)，也有顯著性差異（P<0.01），但與正常對照組比則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05，圖2，表3）。三組肝組織PKB1 mRNA水平有類似的變化（圖3，表3）。

表3 各組大鼠肝組織PI3K和PKB1mRNA水平（±s）的變化

表3 各組大鼠肝組織PI3K和PKB1mRNA水平（±s）的變化

與模型組比，①P<0.01

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圖2 肝組織PⅠ3KmRNA水平變化

圖3 肝組織PKB1 mRNA水平變化

討論

肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的中間環(huán)節(jié)。近年來，隨著肝纖維化發(fā)病機(jī)制的逐漸闡明，人們改變了肝纖維化不可逆轉(zhuǎn)的觀點(diǎn)，阻斷及逆轉(zhuǎn)肝纖維化成為該領(lǐng)域研究的重大課題。

研究表明，間質(zhì)細(xì)胞，尤其是HSC在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。在正常情況下，HSC處于靜止?fàn)顟B(tài)，多種細(xì)胞因子和化學(xué)介質(zhì)均可作用于該細(xì)胞，經(jīng)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑使其激活[14]，活化的HSC主要特征包括HSC增殖和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá)[15]。激活的HSC通過自分泌和旁分泌合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)在肝內(nèi)沉積，直接造成肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的過度增生，從而導(dǎo)致肝纖維化。

研究表明，PDGF是目前已知多肽生長因子中對HSC作用最強(qiáng)的有絲分裂原。PDGF能夠強(qiáng)烈刺激HSC增殖、遷移，促使其膠原的產(chǎn)生和沉積，在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。PDGF具有三種形式的二聚體亞型，即PDGF-AA、PDGF-BB和PDGF-AB。PDGF必須與細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合后才能發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。PDGFR分子由α（PDGFR-α）和β（PDGFR-β）兩種亞單位組成，因此PDGFR也具有三種不同的二聚體亞型，即PDGFR-αα、PDGFR-ββ和PDGFR-αβ。研究證明在肝纖維化時(shí)HSC表面的PDGFR以β受體為主，與PDGF-BB具有較強(qiáng)的親和力，故PDGF-BB和PDGFR-β在肝纖維化發(fā)生過程中的作用尤為突出[16，17]。已經(jīng)證實(shí)在肝纖維化時(shí)PDGF-BB mRNA水平明顯上調(diào)[18]。PDGF在HSCs內(nèi)主要通過Ras/ERK途徑、PI3K/PKB途徑和JAK/STAT途徑來介導(dǎo)對HSC的激活。越來越多的研究顯示磷脂酰肌醇-3（PI3K）激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在肝纖維化的發(fā)生中有著重要的作用。PI3K是一類特異性磷酸化肌醇磷脂3位羥基的激酶，是生長因子受體超家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要成員。PKB則是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，因是病毒v-Akt的產(chǎn)物，故又稱Akt。目前發(fā)現(xiàn)PKB有三種亞型，其中以PKB1對肝纖維化作用最為重要。

中藥復(fù)方制劑具有多種藥效成分協(xié)同作用，長期用于抗纖維化的防治研究，已取得了明顯的臨床效果[19]。已證實(shí)肝復(fù)康能對纖維化肝組織PI3K/PKB信號(hào)途徑產(chǎn)生影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比，治療組大鼠肝組織PDGFR-β陽性細(xì)胞數(shù)較模型組明顯減少；肝組織PI3K和PKB1的表達(dá)較模型組明顯下調(diào)。

PDGF可通過PI3K/PKB信號(hào)途徑發(fā)揮作用，PDGF-BB與PDGFR-β結(jié)合后激活PI3K，從而使PI3K、PKB1和α-SMA mRNA水平上調(diào)。中藥肝復(fù)康可干預(yù)PI3K/PKB途徑，使PI3K、PKB1和α-SMA mRNA水平下降，并可明顯抑制PDGFR-β的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PI3K/PKB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了肝纖維化的發(fā)生，而復(fù)方中藥肝復(fù)康對肝纖維化有明確的治療作用，其作用機(jī)制可能與其作用于PI3K/PKB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑并能減少PDGFR-β的表達(dá)有關(guān)，這將為肝纖維化的臨床治療提供新的思路和途徑。

[1]Tang LX，He RH，Yang G，et al.Asiatic acid inhibits liver fibrosis by blocking TGF-beta/Smad signaling in vivo and in vitro.PLoS One，2012，7 （2）:e31350.doi:10.1371/journal.pone.0031350.

[2]Pana TL，Wanga PW，Leub YL，et al. Ⅰnhibitory effects of Scutellaria baicalensis extract on hepatic stellate cells through inducing G2/M cell cycle arrest and activating ERK-dependent apoptosis via Bax and caspase pathway.J Ethnopharmacol，2012，139:829–837.

[3]Tsutomu F，Bryan CF，Suguru Y，et al.Mouse model of carbon tetrachloride induced liver fibrosis:Histopathological changes and expression of CD133 and epidermal growth factor.BMC Gastroenterol，2010，10:79.

[4]吳文娟，楊妙芳，朱人敏.肝星狀細(xì)胞活化的分子生物學(xué)機(jī)制研究進(jìn)展.實(shí)用肝臟病雜志，2009，12（4）：308-311.

[5]Bovenkamp MVD，Groothuis GMM，Meijer DKF，et al.Liver brosis in vitro:Cell culture models and precision-cut liver slices.Toxicol in Vitro，2007，21:545-557.

[6]Francis JE，Scott L F，F(xiàn)ibrogenesis Ⅰ.New insight into hepatic stellate cell activation:the simple becomes complex.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2000，279（1）:G7-11.

[7]Carloni V，Pinzani M，Giusti S，et al.Tyrosine phosphorylation of focal adhesion kinase by PDGF is dependent on ras in hu－，2000，31（1）:131-140.

[8]Ⅰmanishi Y，Maeda N，Otogawa K，et a1.Herb medicine Ⅰnchinko-to（TJ-135）regulates PDGF-BB-dependent signaling pathways of hepatic stellate cells in primary culture and attenuates development of liver fibrosis induced by thioacetamide administration in rats.J Hepatol，2004，41（2）:242-250.

[9]Sotosis Y，Ward SG.Phosphoinositide 3-kinase:a key biochemical signal for cell migration in response to chemokines. Ⅰmmunol Rev，2000，177:217-235.

[10]Kruger GM，Morrison SJ.Brain repair by endogenous progenitors.Cell，2002，110（4）:399-402.

[11]Ⅰwai M，Sato K，Omori N，et al.Three steps of neural stem cells development in gerbil dentate gyrus after transient ischemia.J Cereb Blood Flow Metab，2002，22（4）:411-419.

[12]Xu TT，Jiang MN，Li C，et al.Effect of Chinese traditional compound，Gan-fu-kang，on CCl4-induced liver brosis in rats and its probable molecular mechanisms.Hepatol Res，2007，37:221-229.

[13]張彩華，姜妙娜，李寒姝，等.肝復(fù)康對肝纖維化大鼠肝組織NF-κB、MMP-2和 TⅠMP-2表達(dá)的影響.實(shí)用肝臟病雜志，2011，14（3）：169-172.

[14]汪美鳳，平鍵，成揚(yáng).肝星狀細(xì)胞主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與肝纖維化的關(guān)系.實(shí)用肝臟病雜志，2010，13（6）：466-469.

[15]Naoki U，Yasuyuki S，Hiroaki O，et al.Carbenoxolone inhibits DNA synthesis and collagen gene expression in rat hepatic stellate cells in culture.J Hepatol，2003，39:749-755.

[16]Di Sario A，Bendia E，Svegliati-Baroni G，et al.Rearrangement of the cytoskeletal network induced by platelet-derived growth factor in rat hepatic stellate cells:role of different intracellular signalling pathways.J Hepatol，2002，36（2）:179-190.

[17]Taylor CC.Platelet-derived growth factor activates porcine thecal cell phosphatidylinositol-3-kinase-AKT/PKB and ras-extracellular signal-regulated kinase-1/2 kinase signaling pathways via the platelet-derived growth factor-beta receptor.Endocrinology，2000，141（4）:1545-1553.

[18]李驄，周情，姜妙娜，等.肝復(fù)康對大鼠肝組織血小板衍生生長因子表達(dá)及對膠原合成的影響.實(shí)用肝臟病雜志，2012，15（2）:111-113.

[19]Lou JL，Jiang MN，Li C，et al.Herb medicine Gan-fu-kang attenuates liver injury in a rat brotic model.J Ethnopharmacol，2010，128:131-138.