乙酸預(yù)浸對玉米秸稈蒸汽爆破預(yù)處理的影響

趙鵬翔，吳毅，趙正凱

(國網(wǎng)新源控股有限公司北京非糧醇電聯(lián)產(chǎn)技術(shù)研發(fā)中心，北京 100053)

燃料乙醇屬于生物質(zhì)能源的一種，是清潔可再生能源，具有污染小，容易運輸和貯藏的特點。木質(zhì)纖維素在地球上含量大，分布廣，可再生。因此，以纖維素生產(chǎn)燃料乙醇逐漸成為各國爭相研究的熱點。據(jù)測算，我國農(nóng)作物秸稈資源總量約為6億噸［1-2］，可用作能源和生物質(zhì)產(chǎn)品轉(zhuǎn)化利用的秸稈約4億噸，以稻草、玉米秸、麥秸為主，約占總量的3/4以上［3］。目前生產(chǎn)的大部分燃料乙醇是以玉米、小麥等糧食為原料。如果用我國10%的秸稈用來生產(chǎn)燃料乙醇，則可以生產(chǎn)1 000萬噸纖維素乙醇，替代3 500萬噸谷物，避免與人爭糧的尷尬局面［4］。

木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素構(gòu)成，三者通過基團間的化學(xué)作用力相互結(jié)合在一起的，纖維素被木質(zhì)素與半纖維素包裹在內(nèi)部，從而阻礙了纖維素的水解糖化［5-6］。木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)特點決定了木質(zhì)纖維素必須經(jīng)過預(yù)處理來改變其完整有序的物理結(jié)構(gòu)，以提高其水解性［7］。目前的預(yù)處理方法主要分為機械法、物化法、化學(xué)法以及生物法［8-9］。其中，蒸汽爆破法(STEX)是當(dāng)下最常用的預(yù)處理方法之一，通過高壓水蒸氣的瞬間釋放從內(nèi)部破壞木質(zhì)纖維素的物理結(jié)構(gòu)［10-11］。同時，水在高溫下作為酸性催化劑促進半纖維素水解為木糖等單糖［12］。但由于一定溫度下水能提供的H+有限，通常需要較高的汽爆溫度。而木糖在高溫下會進一步分解為糠醛、乙酸等發(fā)酵抑制物，會乙醇發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用［13］。

作者對STEX法進行了改良，在蒸汽爆破預(yù)處理前先用低濃度的乙酸對玉米秸稈進行預(yù)浸漬。乙酸為有機弱酸，可以提供一定量的H+作為催化劑，使得玉米秸稈中的半纖維素更容易在相對低溫的蒸汽爆破條件下水解為單糖或者低聚糖，從而使得被包裹的纖維素暴露出來，達到增強纖維素的酶水解性。同時，減低蒸汽爆破預(yù)處理的溫度還能減輕木糖等戊糖的進一步降解，減輕糠醛等副產(chǎn)物對后續(xù)乙醇發(fā)酵的抑制作用，提高玉米秸稈的利用率。目前，木質(zhì)纖維素原料在蒸汽爆破預(yù)處理前進行乙酸預(yù)浸漬的研究在國內(nèi)外還未見報道。

1 實驗

1．1 實驗材料

所用原料取自中國河北邯鄲的玉米秸稈，含水量為19．8%。將其洗凈干燥后用錘式破碎機將其粉碎至2～10 mm的小段，在38℃ 烘箱中烘干后取出備用，置于干燥處保存。

1．2 實驗設(shè)計

1．2．1 預(yù)處理 本實驗以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1．0% 的乙酸對玉米秸稈在常溫下以固液比為1∶20(g∶mL)先預(yù)浸60 min，之后以27 MPa的壓力將原料中的水分壓至50%。然后在預(yù)處理反應(yīng)器中分別以190℃(1．25 MPa)、200 ℃(1．55 MPa)、210 ℃(1．90 MPa)保持10 min 后，瞬間(小于0．5 s)釋放壓力。每個溫度都設(shè)置一個空白對照組(水代替乙酸)。

1．2．2 酶水解 酶水解實驗分別以玉米秸稈預(yù)處理后的整個草漿(包括液體與固體部分)為底物進行。其中，纖維素酶為Cellic CTec2(諾維信，丹麥)，酶用量為每克底物10 FPU，底物濃度為5%，酶水解實驗在溫度45℃，pH值5的條件下進行96 h。

1．2．3 同步糖化發(fā)酵 同步糖化發(fā)酵的條件:底物濃度為10%，溫度35℃，pH值5．5，發(fā)酵時間為96 h;釀酒酵母(J?stbolaget，瑞典)用量為每升發(fā)酵液3 g，纖維素酶為Cellic Ctec2，酶用量為每克底物10 FPU;培養(yǎng)液中(NH4)2PO3的濃度為0．5 g/L，MgSO4·7H2O 的濃度為0．025 g/L。

1．3 測定指標(biāo)與方法

1．3．1 組成成分分析 玉米秸稈組成成分分析以及底物的固形物含量均采用NREL的相關(guān)方法進行測定［14］。

1．3．2 纖維素酶活測定 試管中放入1 cm×6 cm Whatman No．l濾紙(約50 mg)一條，加入0．5 mL適當(dāng)稀釋的纖維素酶液和1 mL檸檬酸鈉緩沖液(pH值4．8)，于50℃保溫振蕩30 min?？瞻自囼炛谐敢菏孪葴缁钔猓溆鄺l件不變。一個濾紙酶活力單位(FPU)等于酶促反應(yīng)中每分鐘生成1．0 μmol葡萄糖(以還原糖表示)所需的酶量［15］。

1．3．3 糖及抑制物濃度分析 單糖、乙醇以及抑制物用島津Prominence LC-20AT高效液相色譜進行定量分析，檢測器為折光檢測器。其中，葡萄糖和木糖等單糖用色譜柱為Aminex HPX-87H(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)分離，柱溫85℃，以超純水為流動相，流速0．5 mL/min。乙醇、糠醛、羥甲基糠醛以及乙酸用色譜柱Aminex HPX-87H(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)進行分離，柱溫為50℃，流動相為0．5 mmol/L的硫酸，流速為0．5 mL/min。HPLC分析前，所有測試樣品以0．20 μm的微濾膜過濾。

1．4 計算方法

2 結(jié)果與分析

2．1 玉米秸稈預(yù)處理后的組成成分分析

實驗所用玉米秸稈干物質(zhì)組成為:纖維素33．6%，半纖維素22．8%，木質(zhì)素14．1%，抽提物17．4%。其中，抽提物中主要含有的是一些油脂、蛋白質(zhì)、淀粉等易溶于水或有機溶劑的物質(zhì)。

按1．2．1節(jié)的預(yù)處理條件分別在190、200以及210℃ 下經(jīng)乙酸預(yù)浸汽爆預(yù)處理10 min及未用乙酸預(yù)浸汽爆預(yù)處理玉米秸稈的成分分析見表1?？梢悦黠@看出，秸稈中的3種主要成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)發(fā)生了較大的變化，纖維素和木質(zhì)素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)得到了一定程度的提高，而半纖維素則有所下降。隨著汽爆預(yù)處理溫度的提高，各成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化的程度越大。當(dāng)溫度從190℃ 上升至210℃ 時，纖維素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從58．2% 上升至64．4%;半纖維素則從9．9% 下降至3．2%;而木質(zhì)素則從26．9% 上升至33．1%。與未經(jīng)乙酸預(yù)浸相比，玉米秸稈經(jīng)乙酸預(yù)浸后，蒸汽爆破預(yù)處理對半纖維素的水解更為徹底，纖維素含量提升的程度更大。

表1 玉米秸稈汽爆預(yù)處理后的組成成分分析Table 1 Composition analysis of pretreated corn stover

2．2 玉米秸稈預(yù)處理后的纖維素和半纖維素回收率分析

對按1．2．1節(jié)的預(yù)處理條件預(yù)處理后和纖維素和半纖維素回收率進行計算，結(jié)果見表2。從表2可以看出，蒸汽爆破預(yù)處理前不管是否經(jīng)過乙酸預(yù)浸漬，對秸稈中葡萄糖的回收率幾乎沒有影響。而其回收率高于100%的原因，可能是秸稈中存在一定的淀粉。對于半纖維素而言，相較纖維素更容易被水解，大部分半纖維素被水解為單糖或低聚糖。隨著預(yù)處理溫度的提高，秸稈中殘留的半纖維素越少，液體部分中的木糖回收率逐漸降低，說明溫度的升高會促進木糖的進一步分解。乙酸預(yù)浸玉米秸稈中的半纖維素在相對低溫的條件下更容易在汽爆過程中發(fā)生水解。以190℃為例，未經(jīng)乙酸預(yù)浸秸稈中還殘留57．3% 的木糖，而乙酸預(yù)浸秸稈中僅殘留38．7%。此外，從水解液中的木糖回收率來看，前者僅為47．7%，后者為67．8%，說明乙酸預(yù)浸更有利于避免木糖的進一步分解。

Linde等［16］以0．2%H2SO4為預(yù)浸試劑，在190℃ 下維持10 min后蒸汽爆破，水解液中的木糖產(chǎn)量為75．9%，這說明強酸更有利于半纖維素的水解。

表2 玉米秸稈汽爆預(yù)處理后葡萄糖以及木糖回收率分析Table 2 Recovery of glucose and xylose in the solid and liquid fraction of pretreated corn stover

2．3 抑制物分析

圖1顯示了玉米秸稈預(yù)處理后的抑制物糠醛、羥甲基糠醛以及乙酸的生成情況。糠醛和羥甲基糠醛分別來源于木糖和葡萄糖的進一步分解，而乙酸則是由半纖維素側(cè)鏈上的乙酰基生成。從圖1可以看出，相比未經(jīng)乙酸預(yù)浸，玉米秸稈經(jīng)乙酸預(yù)浸汽爆預(yù)處理后產(chǎn)生的羥甲基糠醛沒有明顯增加。由于木糖在酸性條件下更容易繼續(xù)分解，所以玉米秸稈經(jīng)乙酸預(yù)浸汽爆預(yù)處理后產(chǎn)生的乙酸和糠醛的量有一定程度增加。隨著預(yù)處理溫度的提高，抑制物的產(chǎn)量也逐漸增加。當(dāng)溫度從190℃上升至210℃ 時，乙酸產(chǎn)量從每克原料24．1 mg增加至42．6 mg;糠醛則由每克原料 4．7 mg 上升至 13．2 mg。因此，為減少抑制物的生成，提高原料利用率，玉米秸稈更適合以乙酸為預(yù)浸試劑在相對較低的溫度下進行汽爆預(yù)處理。

2．4 酶水解

2．4．1 葡萄糖產(chǎn)量分析 從圖2可以看出，未經(jīng)乙酸預(yù)浸玉米秸稈分別以190、200以及210℃ 進行汽爆預(yù)處理后，酶水解得到的葡萄糖產(chǎn)量分別為每克原料207、258和284 mg，為理論值的55．5%、69．2% 和76．8%?？梢钥闯?，相應(yīng)溫度下1．0% 乙酸預(yù)浸汽爆玉米秸稈酶水解得到的葡萄糖產(chǎn)量分別為每克原料253、284以及290 mg，為理論值的67．8%、76．8% 和77．7%，均高于相同溫度下的未經(jīng)乙酸預(yù)浸玉米秸稈。乙酸預(yù)浸汽爆預(yù)處理的最佳溫度為200℃，與未經(jīng)乙酸預(yù)浸相比提高了10．2%。這可能是因為乙酸預(yù)浸汽爆預(yù)處理更大程度地增加了秸稈中纖維素的含量，使更多的纖維素暴露出來，增加了與纖維素酶的接觸面積。

Varga等［17］采用兩步預(yù)處理法，先以1% 的NaOH浸泡玉米秸稈，去除秸稈中的木質(zhì)素;再以1%的H2SO4在120℃下蒸煮1 h后進行酶水解糖化，可以將95．7%的纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖。這是因為經(jīng)過兩步預(yù)處理后，秸稈中的木質(zhì)素和半纖維素基本被完全去除，剩下的纖維素能夠很容易在纖維素酶的作用下水解為葡萄糖。

2．4．2 木糖產(chǎn)量分析 由圖3可以看出，未乙酸預(yù)浸玉米秸稈分別以190、200以及210℃進行汽爆預(yù)處理后，經(jīng)酶水解獲得的木糖產(chǎn)量分別為每克原料35、35和14 mg，為理論值的13．8%、13．8% 和5．5%。相應(yīng)溫度下乙酸預(yù)浸汽爆玉米秸稈酶水解得到的木糖產(chǎn)量分別為每克原料33、41和34 mg，為理論值的13．0%、16．2% 和13．4%。由于大部分半纖維素在蒸汽爆破預(yù)處理中已被水解為單糖，剩余秸稈固體纖維中只剩下小部分半纖維素。因此，是否經(jīng)過乙酸預(yù)浸對酶水解后的木糖產(chǎn)量影響不大，但乙酸預(yù)浸后的總木糖產(chǎn)量更高。

2．5 同步糖化發(fā)酵

經(jīng)過96 h的同步糖化發(fā)酵，從圖4(a)可以看出，未經(jīng)乙酸預(yù)浸汽爆預(yù)處理過的玉米秸稈的同步糖化發(fā)酵獲得的乙醇濃度為19．0 g/L，相當(dāng)于每克原料可以獲得0．121 g乙醇，為理論值的60．1%。從圖4(b)可以看出，以乙酸預(yù)浸汽爆預(yù)處理過的玉米秸稈草漿為底物進行的發(fā)酵并沒有受到糠醛等抑制物的影響。發(fā)酵進行96 h后的乙醇濃度達到22．5 g/L，相當(dāng)于每克原料可以獲得0．143 g乙醇，為乙醇產(chǎn)率理論值的72%。這說明乙酸預(yù)浸可以提高汽爆預(yù)處理對玉米秸稈纖維素酶水解性的增強效果，導(dǎo)致更多的纖維素被水解為單糖，進而在發(fā)酵過程中被釀酒酵母轉(zhuǎn)化為乙醇。

在Sassner等［18］的研究中，柳樹枝經(jīng)0．5%H2SO4預(yù)浸，200℃ 維持8 min汽爆后經(jīng)過同步糖化發(fā)酵獲得16 g/L的乙醇，為理論值的78%。雖然該研究獲得的乙醇濃度并沒有達到本研究的22．5 g/L，但是其乙醇產(chǎn)量卻高于本研究的72%，相比未經(jīng)乙酸預(yù)浸過的玉米秸稈，提高了11．9個百分點。究其原因，可能是玉米秸稈的纖維素含量高于柳樹枝，酶水解糖化后獲得的葡萄糖的量更大，導(dǎo)致其未能充分地被釀酒酵母利用。此外，也有可能是其所用的酵母產(chǎn)乙醇的能力更強。

圖1 乙酸預(yù)浸前后各抑制物的產(chǎn)量Fig．1 Yields of inhibitors before and after HAc impregnation

3 結(jié)論

3．1 與未經(jīng)乙酸預(yù)浸相比，在較低的汽爆溫度下，乙酸預(yù)浸汽爆預(yù)處理玉米秸稈對半纖維素的水解程度更大，并且木糖回收率更高;此外，糠醛等發(fā)酵抑制物并沒有明顯增加。

3．2 綜合考慮過程中的能耗以及發(fā)酵抑制物等因素，玉米秸稈乙酸預(yù)浸汽爆預(yù)處理的最佳溫度為200℃。酶水解后每克原料葡萄糖產(chǎn)量為284 mg，相比未經(jīng)乙酸預(yù)浸玉米秸稈提高了10．2%，為理論值的76．8%;由于大部分半纖維素已經(jīng)在預(yù)處理過程中被水解，所以是否經(jīng)過乙酸預(yù)浸漬對酶水解木糖產(chǎn)量的影響并不大。但是乙酸預(yù)浸可以獲得更高的木糖總產(chǎn)量。

3．3 乙酸預(yù)浸玉米秸稈在200℃ 下汽爆預(yù)處理后的同步糖化發(fā)酵效果較好，經(jīng)過96 h發(fā)酵，乙醇濃度達到22．5 g/L，為理論值的72%，相比未經(jīng)乙酸預(yù)浸過的玉米秸稈，提高了11．9個百分點。說明乙酸預(yù)浸可以增強蒸汽爆破對玉米秸稈的預(yù)處理效果，提高原料利用率。

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