蛹蟲草菌株的栽培與篩選

吳憲，張國財(cái)，張杰＊，王連寬，趙博，王婷玉，林連男，張卓然

（1.東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040；3.大楊樹林業(yè)局）

蛹蟲草〔Cordyceps militaris（vuill.）Fr.〕又稱北冬蟲夏草、北蟲草，屬子囊菌類麥角菌目、麥角菌科、蟲草屬［1］。其藥用價(jià)值與臨床功效與天然冬蟲夏草極為相似。天然冬蟲夏草〔Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc〕是我國傳統(tǒng)名貴中藥，具有抗衰老、抗病原微生物、抗腫瘤等多種功效［2］。但至今未能實(shí)現(xiàn)有效的子實(shí)體人工培養(yǎng)及規(guī)模化生產(chǎn)，無法滿足市場的大量需求。而人工栽培的北蟲草作為野生蟲草的替代品，市場空間大，效益高。因此，本文對6個蛹蟲草菌株進(jìn)行菌落培養(yǎng)、人工栽培，并對子實(shí)體生物轉(zhuǎn)化率與主要活性物質(zhì)含量進(jìn)行分析比較，篩選出優(yōu)良菌株，為規(guī)?；a(chǎn)提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

1號菌株來自沈陽棋盤山；2號菌株來自沈陽于洪區(qū)；3號菌株來自遼寧錦州；4號菌株來自于東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；5、6號菌株均來自綏化市望奎縣。以上蛹蟲草菌株均保存于東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林保護(hù)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA加富培養(yǎng)基：馬鈴薯200g／L（煮汁），葡萄糖20g／L，蛋白胨5g／L，瓊脂20g／L，KH2PO42g／L，MgSO41g／L，VB150mg／L。液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200g／L（煮汁），葡萄糖20g／L，蛋白胨7g／L，KH2PO42g／L，MgSO4g／L，VB150mg／L。營養(yǎng)液：馬鈴薯200g／L（煮汁），KH2PO42g／L，MgSO41g／L，蛋白胨5g／L，取500mL培養(yǎng)瓶，每瓶加入小麥30g，培養(yǎng)液50mL，121℃滅菌40min，冷卻過夜。

1.2 方法

1.2.1 菌落培養(yǎng)方法

用經(jīng)滅菌直徑為5mm打孔器取活化的蛹蟲草菌片接種于PDA平板正中央，封口于22℃自然光下連續(xù)培養(yǎng)19d，每隔2d測定菌落直徑，觀察顏色變化，測定生長速率。

1.2.2 人工栽培方法

將活化后的蛹蟲草菌餅接入裝有100mL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，22℃往復(fù)震蕩培養(yǎng)7d，靜置1d確保無雜菌后，用無菌水稀釋5倍即為栽培用液體菌種。無菌操作接液體菌種5mL于培養(yǎng)瓶中，置于發(fā)菌室中于18℃，濕度為60%條件下，避光培養(yǎng)7d，待菌絲長滿后在聚丙烯膜上扎眼，在22℃，環(huán)境濕度為80%～90%條件下培養(yǎng)45d，每日散射光照12h，記錄形態(tài)，采收，60℃恒溫烘干至恒重保存。

1.2.3 子實(shí)體營養(yǎng)成分測定

蟲草酸含量測定［3］（甘露醇）：將干燥的子實(shí)體放入電動粉碎機(jī)中粉碎，取粉末2.5g于100mL燒瓶中，60mL 50%乙醇溶液，沸水浴進(jìn)行3h回流，真空抽濾，收集濾液稀釋2000倍后，取1mL于試管中依次加入1mL高碘酸鉀稀鹽酸溶液（15mmol／L），2mL鼠李糖溶液（1mg／mL），4mL新鮮Nash試劑，53℃水浴恒溫15min，快速冷卻后用紫外分光光度計(jì)測定其在412nm波長下吸光度。

粗多糖含量測定：取1g研磨好的子實(shí)體粉末加入5mL蒸餾水，20mL無水乙醇，渦旋震蕩，超聲30min，4000r／min離心10min，棄上清，沉淀用80%乙醇溶液清洗2次，加入蒸餾水50mL，沸水浴回流3h，過濾收集取上清液，稀釋1000倍后備用，采用硫酸苯酚法測定［4］，紫外分光光度計(jì)測得490nm吸光度。

蟲草素及腺苷含量測定［5］：取蛹蟲草粉末1g加入6mL乙醚超聲3次，3000r／min離心10min，棄上清，揮發(fā)盡乙醚，加入蒸餾水8mL，超聲3次，過濾，合并濾液，60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，用6%乙腈溶液溶解，0.22μm濾膜過濾后備用。采用高效液相色譜法（HPLC）測定蟲草素、腺苷含量：流動相：6%乙腈溶液；流速：0.6mL／min；檢測波長：260nm；保留時間：15min。蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y＝2E－08 x＋4E－05，r＝0.9998；腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y＝2E－08 x－0.0003，r＝0.998。

2 結(jié)果分析

2.1 菌落培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 不同菌株菌絲生長試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，2號菌株生長最快，菌落整齊，轉(zhuǎn)色較好，3號菌株萌發(fā)遲緩、長勢差、轉(zhuǎn)色慢。

2.2 人工栽培試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 人工栽培子實(shí)體描述

2號與5號菌株子實(shí)體橙黃色，柄粗，頭部膨大呈球形，部分頭部發(fā)白，出草整齊均勻，長勢密集；1號菌株橙黃色，柄細(xì)，子實(shí)體矮小，長勢稀疏；4號子實(shí)體橙黃色，柄粗，子實(shí)體矮小，長勢稀疏；3，6號菌株子實(shí)體橙黃色，柄粗細(xì)適中，長勢疏密適中，子實(shí)體長度適中。

圖1 不同菌株人工栽培子實(shí)體形態(tài)

2.2.2 人工栽培實(shí)驗(yàn)結(jié)果

每種菌株隨機(jī)抽取30瓶蛹蟲草進(jìn)行樣品處理，稱得其鮮草重量、干草重量，計(jì)算出平均鮮重、干重以及鮮干比與生物轉(zhuǎn)化率。由表2可知，2號菌株的平均干重和鮮重等均高于其它菌株。說明2號的產(chǎn)量最高，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

表2 不同菌株人工栽培試驗(yàn)結(jié)果

2.3 子實(shí)體活性成分分析

提取并測定不同菌株中所含的活性物質(zhì)：蟲草酸、粗多糖、蟲草素、腺苷的含量作為篩選優(yōu)良菌株的重要指標(biāo)。高效液相色譜法測定蟲草酸、腺苷含量。由表3可知，2號菌株和5號菌株所含活性成分含量均高于其它菌株。

圖2 高效液相色譜圖

表3 不同菌株子實(shí)體活性成分分析試驗(yàn)結(jié)果 mg·g－1

3 結(jié)論

通過對不同蛹蟲草菌株的菌絲生長狀態(tài)的觀察與生長速率的測定，人工栽培子實(shí)體形態(tài)的觀察及生物轉(zhuǎn)化率的測定以及對不同菌株子實(shí)體中活性成分的測定與分析，得出以下結(jié)論：6種蛹蟲草菌株中的2號菌株菌絲萌發(fā)快、長勢好，子實(shí)體形態(tài)優(yōu)良、產(chǎn)量高，子實(shí)體中所含活性成分較高。適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，是值得推廣的優(yōu)良菌種。

［1］ 吳畏，高新華，崔星明，等.北冬蟲夏草（Cordyceps militaris）的研究應(yīng)用概況（綜述）［J］.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2000，16（增刊）：99－104.

［2］ Zhu J.S，Halpern G.M，Jones K，The scientific rediscovery of an ancient Chinese medicine herbal：Cordyceps sinensis［J］.Journal of Alternative and Complementary Medicine，1988，4（3）：289－303（I）；4（4）：429－457.

［3］ 葛新，白小蘭，李云蘭，等.分光光度法測定蛹蟲草D－蟲草酸的含量［J］.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，32（4）：317－318.

［4］ 白云娥，王毅，劉許媛，等.冬蟲夏草、亞香棒蟲草中多糖的含量測定［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2001，21（1）：19－20.

［5］ 潘錫強(qiáng)，張?jiān)婙Q，陳曉鴻.用HPLC法測定東方神草沖劑中腺苷的含量［J］.中成藥，1994；16（10）：12－14.