文冠果殼黃酮提取物抑制酪氨酸酶活性的研究

張洪梅 耿 杰 周泉城

(山東理工大學農(nóng)業(yè)工程與食品科學學院，淄博 255049)

文冠果是我國特有的優(yōu)良珍貴木本油料作物，在生物柴油開發(fā)、水土保持、新木材培植以及植物觀賞領(lǐng)域等各方面，都有極大的開發(fā)價值［1］。近年來，由于其較高的工業(yè)、營養(yǎng)價值，越來越受到人們的關(guān)注。如今我國種有大量的文冠木，種仁多用于制取生物柴油，而果殼作為廢棄物未曾得到合理的利用。研究表明，文冠果果殼中含有脂肪酸、皂苷、甾醇、黃酮等多種化學成分。

黃酮是以苯色酮環(huán)為基礎(chǔ)的酚類化合物。多為晶體型固體或無定形粉末，顏色與結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系，一般呈黃色。在自然界中一般以苷類形式存在，并且由于結(jié)合糖的種類、數(shù)量、位置及聯(lián)接方式的不同，可以形成各種各樣黃酮苷類［2］。黃酮類化合物已經(jīng)引起了人們的廣泛重視，因為它幾乎存在于所有綠色植物中，是許多中草藥的有效成分［3］。研究表明黃酮類物質(zhì)有抗氧化和清除自由基的作用;保護心腦血管系統(tǒng)、抗衰老、抗腫瘤、抗癌作用;調(diào)節(jié)免疫能力以及降血糖降血脂等諸多生理功能［4］。黃酮類化合物的功能已經(jīng)被人們認可，因此黃酮類化合物也已經(jīng)廣泛應用。

酪氨酸酶(Tyrosinase)是一種結(jié)構(gòu)復雜的多亞基的含銅氧化還原酶［5］，廣泛存在于人體、動植物及微生物中［6－9］。來源于胚胎神經(jīng)峭細胞，是黑色素代謝和兒茶酚胺的關(guān)鍵酶。酪氨酸酶活性越高，黑色素生成越多;活性被抑制，產(chǎn)生黑色素的能力就相應降低。因此，顏色較深的皮膚中的酪氨酸酶活性要更高一些。要想控制皮膚黑化，可以想辦法抑制酪氨酸酶的活性。酪氨酸酶突變可中斷銅結(jié)合使其催化活性喪失，眼、皮膚白化病是由于酪氨酸酶基因突變所致，而酪氨酸過量異常表達可導致色素沉積性疾病。酪氨酸酶抑制劑可以用于治療雀斑、黃褐斑、老年斑等常見的色素沉積導致的皮膚?。?0］。目前，市場上流行的美白化妝品中增白劑大多是酪氨酸酶抑制劑如熊果苷、維生素C衍生物及一些中藥提取物等［11］。

本試驗旨在確定適合提取文冠果殼中黃酮的溶劑，并對文冠果黃酮對酪氨酸酶的抑制作用進行研究，以期為文冠果殼的合理開發(fā)利用提供思路和依據(jù)，增加文冠果的附加值、提高資源綜合利用效率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

文冠果:陜西金道種業(yè)有限公司;酪氨酸酶(≥30 U/mg):合肥博美生物科技有限公司，酶溶液以pH 6.8磷酸緩沖液配成適宜濃度。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗設(shè)備

101A22E電熱鼓風干燥箱:上海實驗儀器廠;FZ102植物粉碎機:天津泰斯特儀器公司;SHB－111循環(huán)水式真空泵:鄭州金育科貿(mào)有限公司;RE 52－86E旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海亞榮生化儀器廠;TDL－40B離心機:上海安亭科學儀器廠;XW－80A旋渦混合器上海青浦滬西儀器廠;UV－2102紫外－可見分析儀:尤尼柯儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 文冠果殼黃酮提取

1.3.1.1 乙醇浸提流程

文冠果殼→粉碎→石油醚脫脂→乙醇浸提→過濾→濾液濃縮。

取文冠果殼于烘箱中干燥至恒重，粉碎得粉末，稱取粉末20 g，置于200 mL燒瓶中，60～90℃石油醚脫脂3次，時間4 h，液料比5∶1。加入70%的乙醇溶液70℃冷凝回流5 h，液料比7∶1。濾去殘渣，回收乙醇至20%，在濃縮液中加入3倍體積的無水乙醇，攪拌均勻，置于4℃冰箱內(nèi)靜置24 h，進行醇沉以除去蛋白質(zhì)、多糖、樹脂等雜質(zhì)。過濾，除去沉淀物，繼續(xù)回收溶劑得浸膏。浸膏用8倍水量溶解，3 500 r/min離心分離15 min，取上清液作為試驗樣品。

1.3.1.2 水浸提流程

文冠果殼→粉碎→石油醚脫脂→水浸提→過濾→濾液濃縮。

取文冠果殼于烘箱中干燥至恒重，粉碎得粉末，稱取粉末20 g，置于200 mL燒瓶中，60～90℃石油醚脫脂3次，時間4 h，液料比5∶1。加入去離子水(pH值為 10.5～11.5)140 mL，于 90 ℃冷凝回流120 min。濾去殘渣，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，3 500 r/min離心分離15 min，上清液作為試驗樣品。

1.3.2 樣品中黃酮質(zhì)量分數(shù)的測定

1.3.2.1 標準曲線［12］

配制0.1 mg/mL的蘆丁標準溶液，準確移取標準液0.20、0.60、1.00、1.40 mL，分別置于 10 mL 比色管中，加入0.3 mL，5%的亞硝酸鈉，在旋渦混合器上搖勻，靜置5 min，然后加入0.3 mL，10%的硝酸鋁，震蕩搖勻，靜置5 min，最后加入4%的氫氧化鈉2.5 mL，搖勻靜置15 min后定容至刻線?？瞻兹芤簽閰⒈热芤海?10 nm處測定吸光度值。以蘆丁標準溶液濃度(c)對吸光度(A)作回歸處理，得出標準曲線方程。

1.3.2.2 黃酮質(zhì)量分數(shù)計算

文冠果殼醇提取液中的黃酮質(zhì)量分數(shù)按NaNO2－A1(NO3)3比色法顯色法測定［13］。吸取文冠果殼黃酮提取液1 mL于試管中，按標準曲線制備方法操作，測定反應液吸光度。做3個平行試驗，取平均值。根據(jù)標準曲線方程求出提取液中黃酮的質(zhì)量分數(shù)。

計算方法:

回歸方程:Y=0.001 8X+0.003 9，R2=0.996 8

質(zhì)量分數(shù) =NV(Y－0.003 9)/(0.001 8 ×106m)×100%

式中:N為稀釋倍數(shù);V為溶液體積/mL;m為原料重量/g。

1.3.3 抑制酪氨酸酶活性試驗

1.3.3.1 酪氨酸酶活性測定方法及抑制率計算

［14］操作:酪氨酸酶活力以催化L－多巴氧化反應生成多巴醌的二酚酶活力來衡量。試管中加入 L － 多巴 0.4 mL(1.0 mg/mL)，pH 6.8 磷酸緩沖液2.4 mL，30℃水浴保溫10 min后，加入酪氨酸酶0.2 mL(250 U/mL)混和均勻，酶促反應將L－多巴轉(zhuǎn)化為紅色產(chǎn)物多巴醌，在475 nm處有最大吸收。以每分鐘A475增加0.001為1個酶活力單位，酶促反應的速度用每分鐘A475增加值來表示。從混合均勻開始測量，每30秒測定一次，測到7 min。按如下兩式計算相對酶活力和酶抑制率。

式中:A1為無黃酮提取液有底物時的吸光度;A2為無黃酮提取液無底物時的吸光度;A3為有黃酮提取液與底物時的吸光度;A4為有黃酮提取液無底物時的吸光度。

1.3.3.2 不同濃度文冠果黃酮對酪氨酸酶活力的影響

按1.3.3.1 方法，在試管中加入底物溶液 0.4 mL，以及不同量的文冠果黃酮，pH 6.8磷酸緩沖液補充反應液至2.8 mL，30℃水浴保溫10 min，加入酪氨酸酶0.2 mL(250 U/mL)混和均勻后立即測定各反應的吸光度變化，計算抑制率。

1.3.3.3 不同反應順序?qū)σ种谱饔玫挠绊?/p>

其他條件相同，底物、文冠果黃酮和酪氨酸酶按以下3種順序加入:(A)底物與酪氨酸酶反應10 min后加入文冠果黃酮;(B)文冠果黃酮與酪氨酸酶預熱10 min后加入底物進行反應;(C)底物與文冠果黃酮預熱10 min后加入酪氨酸酶進行反應。測定各反應吸光度變化，計算抑制率。

1.3.3.4 不同反應時間下對抑制作用的影響

取定量的底物溶液與定量黃酮提取液于30℃水浴保溫10 min，加入定量的酪氨酸酶反應不同時間，測定有無提取液加入情況下反應液的吸光度變化，計算抑制率。

1.3.3.5 文冠果黃酮對酪氨酸酶的抑制作用類型

其他條件相同，在反應體系加入定量酪氨酸酶，給定文冠果黃酮濃度，測定底物濃度不同時酶促反應的吸光度值，求出相應的反應速度。按Lineweaver－Burk的雙倒數(shù)作圖法作圖，確定抑制作用的類型，得出米氏常數(shù)Km、最大反應速度Vmax。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮質(zhì)量分數(shù)標準曲線的繪制

按1.3.2.1方法操作，測得各濃度下的吸光度。以蘆丁標準品濃度(c)對吸光度(A)作回歸處理。繪出標準曲線，見圖1。得回歸方程:Y=0.001 8X+0.003 9，R2=0.996 8。

圖1 黃酮測定標準曲線

2.2 文冠果黃酮的提取溶劑確定

由表1可知，醇提取法測得黃酮質(zhì)量分數(shù)為2.15%左右而水提取法質(zhì)量分數(shù)在1.82%左右。乙醇提取液黃酮質(zhì)量分數(shù)較高，表明乙醇作為提取劑更加合適。因此選用文冠果殼醇提取液作為抑制劑測定文冠果黃酮對酪氨酸酶活性的抑制作用。

表1 文冠果殼黃酮質(zhì)量分數(shù)

2.3 抑制酪氨酸酶活性試驗

2.3.1 酪氨酸酶催化L－多巴氧化反應

L－多巴在酪氨酸酶作用下轉(zhuǎn)化為紅色產(chǎn)物多巴醌，反應體系中顏色的深淺與生成物濃度成正比。由圖2反應液吸光度隨反應時間的變化可知，反應體系的吸光度隨反應時間的增加而增大，即多巴醌的濃度不斷增加。但曲線斜率的逐漸減小，意味著反應速度降低。7 min時，反應速度為零，因此選擇測定時間為0～7 min。

圖2 酪氨酸酶催化L－多巴氧化反應進程曲線

2.3.2 不同濃度文冠果黃酮對酪氨酸酶活力的影響

由圖3黃酮對酪氨酸酶活性的抑制率可知，文冠果黃酮對酪氨酸酶有抑制作用，反應時間相同時，抑制率隨黃酮濃度增大而增加。但并非呈線性變化。文冠果黃酮對酪氨酸酶活性的抑制作用隨時間的延長而降低。質(zhì)量濃度為0.48 mg/mL的黃酮提取液作用于酪氨酸酶，反應時間為1 min時抑制率為39.3%，反應時間為7 min時，抑制率為25.3%。

圖3 文冠果黃酮對酪氨酸酶活性的抑制作用

2.3.3 不同反應順序?qū)σ种谱饔玫挠绊?/p>

底物、黃酮提取液和酪氨酸酶酶按1.3.3.3所述順序加入。測定各反應吸光度變化，計算抑制率。得出不同反應順序?qū)野彼崦富钚砸种谱饔玫挠绊懸妶D4。

圖4 反應順序?qū)野彼崦富钚砸种谱饔玫挠绊?/p>

由圖4可以看出，反應順序的不同，作用效果差異明顯。在不同反應時間內(nèi)，操作B(文冠果黃酮提取液與酪氨酸酶預熱10 min后加入底物進行反應)的抑制效果都明顯高于A(底物與酪氨酸酶反應10 min后加入文冠果黃酮提取液)、C(底物與文冠果黃酮提取液預熱10 min后加入酪氨酸酶進行反應)。說明在酪氨酸酶催化L－多巴的反應中，文冠果黃酮通過與酶相互作用，影響底物與酶反應，從而達到抑制酶活的效果。

2.3.4 不同反應時間文冠果黃酮對酪氨酸酶抑制作用的影響

定量的底物溶液、黃酮提取液與酪氨酸酶反應不同的時間，測定有無黃酮提取液加入情況下反應液的吸光度變化，得出不同反應時間時文冠果黃酮對酪氨酸酶抑制率的變化見圖5。

圖5 反應時間對酪氨酸酶活性抑制作用的影響

由圖5可以得知:不同濃度的黃酮提取液對酪氨酸酶活性抑制作用的變化趨勢一致，反應初始時抑制率最高，隨時間的延長逐漸降低。最高抑制率45.1%，由黃酮質(zhì)量濃度為0.48 mg/mL時反應初始測得，當反應進行到7 min時，抑制率降到25.3%。

2.3.5 文冠果黃酮對酪氨酸酶抑制作用類型

在文冠果黃酮濃度及酪氨酸酶一定的情況下，測定不同底物濃度時反應體系吸光度的變化，求出相應反應速率，作反應速率隨底物濃度變化圖，結(jié)果如圖6所示。

用底物濃度的倒數(shù)和反應速率的倒數(shù)做Lineweaver－Burk圖，見圖7。

從圖7可以得知:未加文冠果黃酮提取液的試驗組動力學參數(shù) Km=1.05 mg/mL，Vmax=0.119 ΔA/min。加入提取液的試驗組動力學參數(shù) Km=1.23 mg/mL，Vmax=0.116 ΔA/min。2 條直線相交于第二象限并非交于橫軸上，加提取液組Km減增大，說明文冠果黃酮提取液對酪氨酸酶的抑制作用類型不是單純的非競爭性抑制。加入文冠果黃酮組最大反應速度減小，競爭性抑制作用最大反應速度應不變，表明也不是單純的競爭性抑制作用。由于文冠果黃酮僅采用乙醇浸提未進行純化，提取液中可能含有其他成分，因此不排除同時含有競爭性抑制劑和非競爭性抑制劑多種有效成分，抑制機理有待于進一步研究。

3 結(jié)論

3.1 醇提取法測得文冠果黃酮的質(zhì)量分數(shù)為2.15%左右，水提取法質(zhì)量分數(shù)1.82%左右。經(jīng)比較得知乙醇提取法測得文冠果殼中黃酮物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)更高。從資源利用率上來講，乙醇提取法比水取提法好。

3.2 本研究發(fā)現(xiàn)，文冠果黃酮對酪氨酸酶的活性存在抑制作用，且隨濃度的增加抑制劑對酶活性的抑制作用顯著增強，當黃酮質(zhì)量濃度為0.48 mg/mL時，抑制率最高可達45.1%。因此，文冠果黃酮具有美白作用。此研究既實現(xiàn)了果殼廢物利用，也符合當前以天然物質(zhì)為美容成分的發(fā)展趨勢，提高了農(nóng)產(chǎn)品的利用率和經(jīng)濟價值。

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