罐組式逆流提取刺五加葉中抗氧化活性成分工藝研究

宗永輝，徐照輝

（1.浙江省人民醫(yī)院，浙江 杭州 310014； 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

刺五加葉為五加科五加屬刺五加 Acanthopanax senticosus Harms的干燥葉，主要分布于中國東北、韓國、日本的北海道和俄羅斯的遠(yuǎn)東等地區(qū)，《本草綱目》稱之為“上品”，能“補中益氣，堅筋骨強意志，久服輕身耐老”。其根、莖、葉、花和果實均可入藥，其性溫，味苦、微辛，無毒，具有補腎健脾、益智安神等功效。目前人們對刺五加的需求量日益增加，但野生的刺五加資源已經(jīng)瀕臨滅絕。刺五加的各部位均含有黃酮類化合物，其中以葉中含量最高。研究表明，蘆丁、金絲桃苷、槲皮素等黃酮類化合物是刺五加中的活性成分[1－3]。鑒于刺五加葉也具有較高的藥用價值，將其開發(fā)利用，有利于保護藥用刺五加資源。目前關(guān)于刺五加葉中抗氧化活性成分的提取工藝研究尚未見報道。本試驗采用正交試驗設(shè)計，以總黃酮、總酚含量及DPPH自由基(DPPH·)清除率為指標(biāo)，通過全概率值統(tǒng)計分析，考察固液比、提取時間和提取溫度對提取工藝的影響，確定罐組式逆流提取刺五加葉中抗氧化活性成分的最佳提取工藝條件，為進一步刺五加葉抗氧化活性成分的臨床應(yīng)用和新藥開發(fā)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

BS224S型精密電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；TU－1900型雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；ZHWY－200B型恒溫震蕩器(上海智城分析儀有限公司)；R－201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申順科技儀器公司)。DPPH·（美國 Sigma公司，批號為 S44112－089）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號為100080－20030）；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號為110831－200302）；刺五加葉藥材（浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠），經(jīng)陳孔榮副教授鑒定為刺五加葉 Acanthopanax senticosus Harms的干燥葉；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮的測定

線性關(guān)系考察：精密稱取干燥恒重的蘆丁對照品20.0 mg，加60%乙醇溶解定容于25 m L容量瓶，得質(zhì)量濃度為0.80 g／L對照品溶液，備用。精密吸取對照品溶液 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置 25 mL 容量瓶中，加入 5%NaNO21.0 mL，搖勻，放置 6 min后加入 10%Al(NO3)31.0 m L，搖勻，放置 6 min后加入 10%NaOH 10 mL，再加 60%乙醇稀釋至 25m L，混勻，靜置15 min，于510 nm波長處，同行試劑空白，測定吸光度[4]，以吸光度值為橫坐標(biāo)、蘆丁質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y＝5.572X －50.35（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，蘆丁質(zhì)量濃度在0.4～4.0 g／L范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

樣品含量測定：取提取液適量，依法操作，測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算樣品中總黃酮的含量，并計算總黃酮提取率。

2.2 總酚的測定

線性關(guān)系考察：精密稱取5.2mg干燥沒食子酸對照品，用蒸餾水溶解，定容至50 m L量瓶中，配成164μg／m L對照品溶液。精密吸取 0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 m L 沒食子酸對照品溶液分別定容于10m L量瓶內(nèi)。從各溶液中吸取1m L加入25mL量瓶內(nèi)，加10m L蒸餾水，搖勻，再加1 m L福林酚試劑，充分搖勻30 s，放置約 8 min后，加入 10%Na2CO3溶液4 m L，混勻，加水定容，再混勻，然后在70℃下避光放置反應(yīng)10 min。以試劑空白為參比，于765 nm波長處測定吸光值[5]。以吸光值為橫坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y＝1 765 X＋50.35（r＝ 0.999 2）。結(jié)果表明，沒食子酸質(zhì)量濃度在 0.082 ～0.984 g／L范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

樣品含量測定：精密吸取提取液0.3 mL，依法操作，測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算樣品中總多酚的量，并計算總酚提取率。

2.3 DPPH·清除率的測定

取適量濃度的提取液 0.5mL，加入 0.13mmol／LDPPH·乙醇溶液 0.5mL，快速混勻，加 60% 乙醇 4.0mL，混勻，靜置 15min后于517 nm波長處測定該溶液的吸光度。清除率[6]＝[DPPH·]t＝0－[DPPH·]t＝15／[DPPH·]t＝0× 100% 。其中[DPPH·]t＝0表示 0 時刻體系的吸光度，[DPPH·]t＝15表示15 min時體系的吸光度。

2.4 罐組式逆流提取正交試驗設(shè)計

每罐稱取藥材5.0 g，由3個250mL圓底燒瓶按圖1所示的逆流提取工藝模型進行試驗。因素和水平安排見表1。選用L9(34)正交試驗設(shè)計表，以總黃酮、總酚含量及DPPH·清除率的全概率值為檢測指標(biāo)?？偡雍俊⒆畲罂偡雍糠謩e記為 A，Amax；總黃酮含量、最大總黃酮含量分別記為 B，Bmax；DPPH·清除率、最大清除率分別記為 C，Cmax。全概率值 ＝ （A／Amax＋ B ／Bmax＋ C ／Cmax） ／3×100%。采用 SPSS 13.0軟件對全概率值進行方差分析，結(jié)果見表2和表3。由表2直觀分析結(jié)果可知，各因素水平對結(jié)果影響的強弱順序是：A3＞ A2＞ A1，B3＞ B2＞ B1，C3＞ C2＞ C1，其影響順序是C＞A＞B。由表3方差分析結(jié)果可知，固液比（A）和提取溫度（C）具有顯著性影響（P ＜ 0.05），而提取時間（B）無顯著性影響（P＞0.05）。因此，根據(jù)方差結(jié)果和實際操作，確定其最佳工藝條件為 A3B1C3，即固液比為 1∶16，提取時間為 30min，提取溫度為80℃。

2.5 工藝驗證試驗

圖1 罐組式逆流提取過程示意圖

表1 因素與水平

為考察上述提取工藝的穩(wěn)定性，按最佳提取工藝進行驗證性試驗，結(jié)果如表4所示，各檢測指標(biāo) RSD均小于3.0%。證明該工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。

2.6 罐組式逆流提取與超聲提取的比較

[7]最佳提取工藝，結(jié)合本試驗的前期研究，取5.0 g藥材，加 20倍量 50%乙醇溶液，超聲提取 1.5 h，提取 2次。過濾，定容，取樣測定刺五加葉總黃酮、總酚含量和DPPH·清除率。罐組式逆流提取與常規(guī)超聲提取的比較結(jié)果見表5?？芍?，逆流提取工藝與常規(guī)回流提取工藝相比，其總黃酮、總酚提取率相當(dāng)，提取物DPPH·清除率亦相當(dāng)，但逆流提取工藝的溶劑消耗量明顯下降，其溶劑消耗量僅為常規(guī)超聲提取工藝的2／5；提取時間也大大縮短，其逆流提取時間僅為超聲提取工藝的1／6，生產(chǎn)效率大幅度提高。由此可見，逆流提取工藝具有效果佳、節(jié)省溶劑、節(jié)約成本、降低后續(xù)濃縮能耗、縮短提取時間等優(yōu)點。

表2 正交試驗結(jié)果

表3 全概率值的方差分析

表4 最佳工藝驗證結(jié)果（%）

表5 不同提取方法間提取效果的比較

3 討論

自由基是生物體生化反應(yīng)的普遍介質(zhì)，在正常生理情況下，活性氧的產(chǎn)生與清除可維持在一個有利無害的極低水平，但其在衰老、應(yīng)激、疾病的情況下對機體就產(chǎn)生不利的影響?，F(xiàn)代研究表明，許多疾病如動脈粥樣硬化、中風(fēng)、肝硬化、癌癥、關(guān)節(jié)炎、白內(nèi)障以及人體衰老等過程都與自由基的作用有關(guān)[8]。

DPPH·是一種人工合成的穩(wěn)定自由基，能與多種結(jié)合體發(fā)生反應(yīng)，用于表征各種抗氧化物的自由基清除能力。由于該分析方法測定簡便、快速、靈敏、重現(xiàn)性好，被廣泛用于清除自由基物質(zhì)性質(zhì)的研究與天然抗氧化劑的篩選[9]。因此，本試驗采用化學(xué)和藥效相結(jié)合的方法，通過測定提取液中總黃酮、總酚含量以及DPPH·清除率，綜合評價提取工藝的優(yōu)劣，使之更具科學(xué)性，避免了傳統(tǒng)以單一指標(biāo)進行提取工藝優(yōu)化的片面性和矛盾性。

目前，刺五加葉中黃酮類成分的提取方法有回流提取法、浸提法、超聲提取等[7]，但存在著提取率低、提取時間長、溶劑用量大、后續(xù)工作能耗大等缺點，不利于刺五加葉資源的開發(fā)。罐組式逆流提取技術(shù)是近十年來發(fā)展起來的新技術(shù)，主要利用了固液（藥材與溶劑）兩相中有效成分的濃度梯度差[10]，逐級將藥材中有效成分?jǐn)U散至起始濃度較低的提取溶劑中，達到最大限度轉(zhuǎn)移藥材中有效成分的目的。與傳統(tǒng)生產(chǎn)技術(shù)相比，罐組式逆流提取技術(shù)能大大減少溶劑用量，提高提取率，降低能耗[11－13]。研究表明，該提取技術(shù)確保了各提取單元的藥材與溶劑始終保持較大的有效成分濃度差，可大大增加提取推動力，加快提取速率，提高最終溶劑有效成分的濃度，降低后續(xù)濃縮能耗。

本試驗研究亦發(fā)現(xiàn)，采用罐組式逆流提取刺五加葉中抗氧化活性成分，其溶劑用量為16 g／mL，僅為傳統(tǒng)的超聲提取工藝的2／5，且提取時間僅為超聲提取工藝的1／6，而所得的提取液中總黃酮、總酚含量以及DPPH·清除率與傳統(tǒng)的回流提取工藝的提取效果相當(dāng)。由此可見，罐組式逆流提取技術(shù)操作相對簡便，提取時間少，電力能源消耗較少，能更好的提高生產(chǎn)效率，值得在中藥生產(chǎn)中推廣。

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