反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定清熱化毒丸中黃芩苷和漢黃芩素含量

劉 匯，趙 晶，李 琨

（1.吉林省延邊朝鮮族自治州食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 延吉 133000; 2.吉林省通化東寶藥業(yè)股份有限公司，吉林 通化 134123； 3.吉林省延邊朝鮮族自治州工業(yè)和信息化局，吉林 延吉 133000）

清熱化毒丸是由黃芩、連翹、青黛、黃連等15味中藥加工而成的中成藥制劑，具有清火化毒、消腫止痛的功效。有關(guān)清熱化毒丸質(zhì)量控制都是采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定制劑中單一成分，沒(méi)有同時(shí)測(cè)定制劑中多種成分的含量。本試驗(yàn)中采用HPLC法同時(shí)測(cè)定制劑中黃芩苷和漢黃芩素兩種成分的含量，以尋求建立同時(shí)測(cè)定制劑中多種成分來(lái)控制制劑質(zhì)量的方法，可為控制清熱化毒丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)方法提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀(四元泵，DAD檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器)，十萬(wàn)分之一天平（賽多利斯）。色譜甲醇（天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心），甲醇為分析純（北京化工廠），水為娃哈哈純凈水，磷酸為優(yōu)級(jí)純（北京化工廠）；黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)為110715－200514），漢黃芩素對(duì)照品（批號(hào)為 1514－200001），均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；清熱化毒丸（北京同仁堂藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)分別為 9013142，9013006，0013010）。

2 方法與結(jié)果[1]

2.1 色譜條件

色譜柱為 Waters SunFire C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇（A）－0.4% 磷酸溶液（B），梯度洗脫，[0～9 min，A：45%(體積分?jǐn)?shù)，下同)；9～25min，A：45% →55% ；25 ～36，A：55%]，流速為 1.0mL ／min，檢測(cè)波長(zhǎng) 278 nm，柱溫 35 ℃ 。

2.2 溶液制備

精密稱取黃芩苷對(duì)照品和漢黃芩素對(duì)照品適量，加70%甲醇制成每 1 m L含黃芩苷 84μg、含漢黃芩素13.6μg的混合溶液，即得對(duì)照品溶液。取本品10丸，剪碎，取約1.0 g，精密稱定，置 50 m L量瓶中，加入70%甲醇 40 m L，浸泡 20 min，超聲處理40 min，放冷，加70%甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按清熱化毒丸制備工藝，取缺黃芩藥材的其余各味藥，制成陰性樣品，取該陰性樣品按2.3項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各10μL，按2.1項(xiàng)下的色譜條件，注入液相色譜儀，結(jié)果顯示供試品與對(duì)照品溶液均在相同保留時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)吸收峰，黃芩苷峰和漢黃芩素峰保留時(shí)間分別為9.9，32.9 min，理論板數(shù)分別大于6 000和30 000，陰性對(duì)照樣品溶液在黃芩苷峰和漢黃芩素峰相應(yīng)位置處無(wú)吸收峰，本測(cè)定無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

線性關(guān)系考察：精密稱取黃芩苷對(duì)照品和漢黃芩素對(duì)照品適量，置50 mL量瓶中，加70%甲醇制成每1mL含黃芩苷84μg，含漢黃芩素13.6μg的對(duì)照品貯備液，再用70%甲醇稀釋成系列對(duì)照品溶液，精密吸取10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，并以峰面積為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，經(jīng)線性回歸，得回歸方程，黃芩苷為 Y＝2 709.2X ＋20.09，r＝0.999 9；漢黃芩素為 Y＝5 064X ＋4.5，r＝0.999 9，結(jié)果表明，黃芩苷和漢黃芩素進(jìn)樣量分別在 0.168～0.840 μg和 0.027～0.136 μg范圍內(nèi)與相應(yīng)峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取上述黃芩苷和漢黃芩素對(duì)照品溶液10μL，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算 RSD分別為0.9%和1.1%，說(shuō)明該方法具有良好的精密度。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批號(hào)樣品，按供試品溶液的制備方法操作，分別于 0，1，2，3，4，5，6 h 精密吸取 10 μL 進(jìn)樣，測(cè)得黃芩苷和漢黃芩素峰面積的 RSD分別為0.9%和1.3%。結(jié)果表明，樣品至少在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批號(hào)樣品6份，按供試品溶液的制備方法操作，分別制備供試液，測(cè)得黃芩苷和漢黃芩素平均含量分別為 0.236%和 0.046%，RSD分別為 1.0%和 1.1%。結(jié)果表明，該試驗(yàn)重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：采用加樣回收法，取已知含量的樣品，精密稱定，分別精密加入一定量的黃芩苷和漢黃芩素對(duì)照品，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按上述測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 高效液相色譜圖

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，按照上述含量測(cè)定方法測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 3批樣品含量測(cè)定

3 討論

經(jīng)紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)在200～400 nm對(duì)黃芩苷和漢黃芩素進(jìn)行全程掃描得到光譜圖顯示，黃芩苷在280 nm和315 nm有最大吸收峰，漢黃芩素在278 nm有最大吸收峰，綜合考慮，在278 nm處測(cè)定含量基線平穩(wěn)，可以兼顧黃芩苷最大吸收波長(zhǎng)，并均達(dá)到基線分離，故確定本文檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm。

本文對(duì)多種流動(dòng)相進(jìn)行了考察，分別比較了甲醇－水、乙腈－水等不同的流動(dòng)相系統(tǒng)，并加入磷酸為改性劑。結(jié)果以甲醇－水為流動(dòng)相，以0.4%磷酸為改性劑，梯度洗脫，各成分峰形較好，分離度高[2]。

對(duì)3批不同批次的樣品黃芩苷和漢黃芩素含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果3批樣品平均含量相當(dāng)，可作為該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：282.

[2]高曉燕，盧建秋.梔子金花丸中梔子苷、黃芩苷、番瀉苷A和番瀉苷B的含量測(cè)定方法研究[J].中國(guó)中藥雜志，2009，34（20）：2 649 － 2 651.