高效液相色譜法測(cè)定金錢草膠囊中槲皮素的血藥濃度＊

王啟平，王洪銳，李 東，朱杰華，林永勝，馮雪科，陳玩珊

(1.廣東省深圳市沙井人民醫(yī)院，廣東 深圳 518104;2.廣東省深圳市福永人民醫(yī)院，廣東 深圳 518103;3.廣東省深圳市人民醫(yī)院·暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳 518020;4.廣東省深圳市大鵬人民醫(yī)院，廣東 深圳 518120;5.廣東省深圳市南澳人民醫(yī)院，廣東 深圳 518121)

金錢草為《中國(guó)藥典(一部)》1985年版、2000年版、2005年 版和2010年版收載的品種[1]，來(lái)源為報(bào)春花科Prmuhceae珍珠菜屬Lysimachia雙子葉植物過(guò)路黃 Lysimachia christinae Hance的新鮮或干燥全草，因其葉子近圓形，很像金錢故名金錢草，又稱銅錢草。四川《百草堂驗(yàn)方抄本》[清代乾隆年間(1736-1795)]中就有金錢草治療“黃痧走疸”的記載，“黃痧走疸周身黃，金錢草是救命王，炕干為末沖甜酒，草藥更比官藥強(qiáng)”，迄今至少有200年的應(yīng)用歷史。金錢草味苦、酸，微寒，歸肝、膽、腎、膀胱四經(jīng)，主治清熱解毒、利尿排石、活血散瘀[2-4]。中藥制劑金錢草膠囊是以金錢草新鮮或干燥全草為原料的單味現(xiàn)代中藥制劑，為中藥八類新藥(國(guó)藥準(zhǔn)字Z20060007)，為全國(guó)獨(dú)家醫(yī)保品種?，F(xiàn)代藥理研究[2-6]證明，金錢草中藥制劑口服可用于肝膽結(jié)石、膽囊炎、黃疸性肝炎、泌尿系結(jié)石、水腫、跌打損傷、毒蛇咬傷、毒蕈及藥物中毒，外用治療化膿性炎癥、燒燙傷。金錢草不良反應(yīng)較少，臨床應(yīng)用越來(lái)越廣泛[4]，但目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)金錢草膠囊血藥濃度測(cè)定方法的報(bào)道。筆者選擇金錢草膠囊中有效成分槲皮素(quercetin)為指標(biāo)，參考國(guó)內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)[1，7-13]，并根據(jù)槲皮素的性質(zhì)，建立了血藥濃度測(cè)定方法，為臨床血藥濃度測(cè)定和藥代動(dòng)力學(xué)研究提供分析手段。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀(G1311A四元泵，G1322A真空脫氣機(jī)，G1315B-DAD檢測(cè)器，D1316A柱溫箱，rheodyne-7725i進(jìn)樣器，ChemStation色譜工作站);AG285型電子天平(梅特勒托利多儀器有限公司);XW-80A型旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠);KQ5200DB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);高速離心機(jī)(雅培公司);pHS-3C型數(shù)字pH計(jì)(上海精科雷磁儀器廠)。金錢草膠囊(四川寶光藥業(yè)有限公司，規(guī)格為每粒裝0.4g，批號(hào)為120203A);槲皮素對(duì)照品(國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，供高效液相色譜法測(cè)定，含量為96.5%，批號(hào)為100081-200907，中國(guó)食品藥品檢定研究院);甲醇(色譜純，天津四友精細(xì)化工有限公司);乙腈(色譜純，天津四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司);β-葡萄糖苷酸酶(H-2型，美國(guó)Sigma公司);硫酸酯酶(H-1型，美國(guó)Sigma公司);磷酸、乙酸乙酯及其他試劑均為分析純，水為注射用水。所有試劑及緩沖液使用前均經(jīng)過(guò)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Kromasil C8柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-乙腈-0.4%磷酸溶液(40∶10∶50);流速:1 mL/min;柱溫:30℃;檢測(cè)波長(zhǎng):360 nm;進(jìn)樣量:20 μL。在此色譜條件下，槲皮素的保留時(shí)間為8.8 min，理論板數(shù)按槲皮素計(jì)計(jì)算不低于3 000，峰對(duì)稱因子(AS)為 1.08，見(jiàn)圖 1。

2.2 溶液配制

精密稱取槲皮素對(duì)照品10 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制得質(zhì)量濃度為400 μg/mL的槲皮素對(duì)照品貯備液，置4℃冰箱中備用。臨用時(shí)分別取槲皮素對(duì)照品貯備液 0.05，0.10，0.50，1.50，2.50，5.00 mL，置 10 mL 容量瓶中，以流動(dòng)相稀釋至刻度，得系列質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液(2.0，4.0，20.0，60.0，100.0，200.0 μg/mL)。精密量取磷酸 4 mL，置 1 000 mL 容量瓶中，加水稀釋，定容至刻度，混合均勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得0.4%磷酸溶液。

2.3 樣品預(yù)處理

取全血4.0 mL，置干燥管中，靜置 30 min，10 000 r/min離心10 min。取上清液，置1.5 mL離心管中，密封，做好標(biāo)記，置-20℃保存直到分析。分析前，血漿樣品室溫自然解凍后，精密吸取0.5 mL，置 10 mL 具塞錐形離心管中，加入 40 μL β -葡萄糖苷酸酶，調(diào) pH 至 4.5～5.0，旋渦混合 30 s，37 ℃ 水解 8 h后，加入乙酸乙酯6 mL(分2次，每次3 mL)，分別旋渦提取5 min，合并萃取液，10 000 r/min離心10 min，取乙酸乙酯層，50℃水浴氮?dú)饬鞔蹈桑瑲堅(jiān)?00 μL甲醇溶解，旋渦30 s，10 000 r/min離心3 min后取20 μL進(jìn)樣。

2.4 方法專屬性試驗(yàn)

分別取6名健康者空白血漿0.5 mL，按2.3項(xiàng)下操作，獲得空白血漿樣品典型色譜圖(圖1 A);將一定濃度槲皮素對(duì)照品溶液加入空白血漿中，同法操作，獲得典型色譜圖(圖1 C);健康受試者口服4粒金錢草膠囊后的血漿樣品，同法處理后得樣品色譜圖(圖1 D)。結(jié)果表明，在上述血漿樣品預(yù)處理及色譜條件下，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)及金錢草膠囊可能的代謝物均不干擾樣品測(cè)定，峰形對(duì)稱性好，基線噪音小。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)限確定

取10 mL具塞錐形離心管8支，分別精密加入健康體檢者混合空白血漿0.5 mL。除空白管外，其余每支管精確加入不同質(zhì)量濃度的槲皮素對(duì)照品溶液20 μL，旋渦混合30 s，得質(zhì)量濃度分別為 0.08，0.16，0.80，2.40，4.00，8.00，12.00 μg/mL 的系列血漿樣品，然后按血漿樣品預(yù)處理方法處理后進(jìn)樣分析，記錄槲皮素峰面積，并以峰面積(A)對(duì)槲皮素對(duì)照品質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 A=385.85 C-32.518，r=0.998 8(n=7)。結(jié)果表明，槲皮素質(zhì)量濃度在0.08～12 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.6 方法回收率及精密度試驗(yàn)

用空白血漿及對(duì)照品溶液配制質(zhì)量濃度為 0.16，2.40，8.00 μg/mL的3種槲皮素質(zhì)控樣品，各6份，按2.3項(xiàng)下方法操作，于1 d內(nèi)重復(fù)測(cè)定6次;連續(xù)6 d，每天配制上述3種質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。將測(cè)定結(jié)果代入線性方程，計(jì)算濃度，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度及方法回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 方法精密度及回收率測(cè)定結(jié)果

2.7 提取回收率試驗(yàn)

取空白血漿0.5 mL，加入槲皮素對(duì)照品溶液適量，分別配制0.16，2.40，8.00 μg/mL 系列質(zhì)量濃度的溶液各 6 份，按 2.3 項(xiàng)下方法處理、測(cè)定;另取空白血漿0.5 mL，不加入槲皮素對(duì)照品，按2.3項(xiàng)下方法處理，在取乙酸乙酯層后加入相同量的槲皮素對(duì)照品溶液，旋渦30 s，同法吹干，復(fù)溶后測(cè)定。將兩組樣品對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的槲皮素峰面積進(jìn)行比較，計(jì)算提取回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 提取回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性考察

用空白血漿配制質(zhì)量濃度為 0.16，2.40，8.00 μg/mL 的槲皮素樣品，各吸取2 mL，置離心管中，每個(gè)質(zhì)量濃度9份。其中3 份在室溫下放置 0，1，2，4，8，12 h 后按 2.3 項(xiàng)下方法處理、測(cè)定;3份進(jìn)行凍融循環(huán)處理，樣品放入-20℃冰箱中冷凍，24 h后解凍、處理、測(cè)定，重復(fù)凍融3次;另外3份分別在-20℃冰箱中保存1，2，4周后，再按2.3項(xiàng)下方法處理、測(cè)定。3個(gè)質(zhì)量濃度樣品在室溫下測(cè)定結(jié)果的 RSD分別為3.90%，3.41%，4.48%，凍融循環(huán)條件下測(cè)定結(jié)果的 RSD分別為4.70%，4.89%，4.03%，冷凍條件下測(cè)定結(jié)果的 RSD為6.98%，4.09%，4.36%。結(jié)果表明，槲皮素樣品在室溫放置和冷凍條件下均有較好的穩(wěn)定性。

3 討論

目前有關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)的研究多集中在化學(xué)藥物，對(duì)中藥藥代動(dòng)力學(xué)的研究相對(duì)較少。中藥藥代動(dòng)力學(xué)的研究與發(fā)展對(duì)于中藥新藥設(shè)計(jì)，改進(jìn)中藥劑型，提供高效、速效、長(zhǎng)效、低毒副作用的中藥制劑，特別是對(duì)于指導(dǎo)臨床合理用藥、推動(dòng)中藥現(xiàn)代化、中藥走向世界都具有重大的現(xiàn)實(shí)意義[14]。金錢草膠囊為中草藥金錢草單方制劑，槲皮素是金錢草的主要有效成分之一，主要以苷的形式存在。為研究金錢草制劑的人體藥代動(dòng)力學(xué)，筆者建立了金錢草膠囊中有效成分槲皮素的血藥濃度測(cè)定方法。

槲皮素屬多羥基黃酮類化合物，具有多種生理活性。曾試用了Hypersil ODS C18柱和Kromasil C8柱兩種色譜柱，峰形上無(wú)明顯差異，但后者的保留時(shí)間更適當(dāng)，因此選用C8柱。配制質(zhì)量濃度為4 μg/mL的槲皮素對(duì)照品甲醇溶液，在200～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在360～374 nm波長(zhǎng)處有明顯吸收。參照文獻(xiàn)[7-8]及《中國(guó)藥典(一部)》[1]，將檢測(cè)波長(zhǎng)定為 360 nm，在此波長(zhǎng)下，溶劑、內(nèi)源性雜質(zhì)及金錢草可能的代謝物均無(wú)干擾。

槲皮素的測(cè)定多以甲醇、乙腈和稀磷酸為基礎(chǔ)流動(dòng)相[1，7-10]，在此基礎(chǔ)上對(duì)最佳流動(dòng)相比例及磷酸濃度進(jìn)行了篩選。槲皮素為多羥基化合物，弱酸性環(huán)境可抑制其解離，有利于其快速分離，曾試驗(yàn)了3個(gè)濃度的磷酸水溶液，最終選擇0.4%。與甲醇和乙腈相比，磷酸溶液的比例可對(duì)分離時(shí)間及峰形產(chǎn)生明顯影響，綜合考慮保留時(shí)間、靈敏度，最終選擇以甲醇-乙腈 -0.4% 磷 酸溶液(40∶10∶50)為流動(dòng)相，保留時(shí)間約為8.8 min，峰形、靈敏度和分離效果好。

植物中以苷形式存在的槲皮素進(jìn)入人體胃腸道，在腸黏膜水解后以苷元的形式吸收，進(jìn)入血液后主要以結(jié)合形式存在，未能檢測(cè)到游離槲皮素[11-12]。因此要測(cè)定人體內(nèi)的槲皮素，需要對(duì)生物樣品進(jìn)行水解，以獲得游離槲皮素苷元[10]。2010年版《中國(guó)藥典(一部)》采用的是酸水解方式[1]，需加熱回流較長(zhǎng)時(shí)間，不適于取樣量較小的生物樣本。在本研究中，血漿樣本的處理采用酶水解后溶劑萃取方式，通過(guò)優(yōu)化水解條件、提取溶劑、提取方式等可獲得較好效果，但不足之處是水解時(shí)間比較長(zhǎng)。對(duì)3名服用金錢草膠囊的志愿者血樣檢測(cè)結(jié)果表明，在優(yōu)化的色譜條件及血樣處理?xiàng)l件下，色譜峰分離度好，內(nèi)源性物質(zhì)無(wú)干擾，專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、線性及最低定量檢測(cè)限符合要求，可用于人體藥代動(dòng)力學(xué)、生物等效性分析。

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