高效液相色譜法檢測中藥制劑中非法添加的抗真菌藥物

盧 奕，張 雁，李 東

(1.廣東省深圳市孫逸仙心血管醫(yī)院，廣東 深圳 518020; 2.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院·深圳市人民醫(yī)院，廣東 深圳 518020)

一些制假者利用中成藥所含成分復(fù)雜、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不完善、添加西藥不易被識別及隱蔽性強的缺點，在中成藥生產(chǎn)過程中非法添加化學(xué)藥品，夸大宣傳療效，高價銷售，牟取不義之財，給用藥者的身體健康造成了嚴(yán)重危害。最常見的添加藥物為降糖藥物、壯陽藥物、抗風(fēng)濕類藥物等，添加手法也不斷變化，典型的案例如“梅花K”(黃柏膠囊)假藥案[1－2]。加強對中成藥非法添加化學(xué)藥品類型及鑒別方法的分析研究，可以進一步提高藥品監(jiān)督管理部門對流通環(huán)節(jié)中假劣中成藥的查處率，使制售假藥違法行為得到有效扼制。目前，市場上有許多純中藥制劑用于治療腳氣、手癬、足癬等真菌感染，聲稱“起效快、不反彈”，此類藥物中存在非法添加化學(xué)抗真菌藥物如酮康唑、克霉唑、硝酸益康唑等的可能，使用不當(dāng)可造成嚴(yán)重肝腎功能損害。因此，建立中藥制劑中非法添加化學(xué)抗真菌藥物的檢測方法極為重要。高效液相色譜(HPLC)法廣泛應(yīng)用于抗真菌藥物的分析中[2－6]，但采用HPLC法同時測定抗真菌中藥制劑中非法添加的化學(xué)藥物，如氟康唑等8種成分尚未見報道。筆者建立了一種HPLC方法可將8種抗真菌藥物分開，可用于中藥制劑中非法添加抗真菌化學(xué)藥物的篩查。

1 儀器與試藥

Alliance高效液相色譜儀，包括Waters2695分離單元(四元梯度洗脫的溶劑輸送系統(tǒng)，四通道在線真空脫氣，自動進樣器，柱溫箱)，Waters2996二級管陣列檢測器，Waters Empower色譜工作站(美國Waters公司);Luna Phenomenx ODS C18色譜柱(廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司);Mettle Toledo XS105DU型電子分析天平(瑞士梅特勒公司);超聲波清洗機(深圳艾斯達(dá)超聲波設(shè)備有限公司)。氟康唑(批號為 100314－20050)，灰黃霉素(批號為0426－9101)，酮康唑(批號為 100294－200602)，克霉唑(批號為100037－200306)，伊曲康唑(批號為 100631－200401)，硝酸益康唑(批號為100214－200903)，硝酸咪康唑(批號為100213－200705)，鹽酸特比萘芬(批號為100563－200301)等對照品均由中國生物制品檢定所提供;磷酸二氫鉀(AR，廣州化學(xué)試劑廠);甲醇(色譜純，默克公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Luna ODS C18柱(250 mm ×4.0 mm，5 μm);流動相:甲醇－0.2%磷酸二氫鉀水溶液，梯度洗脫0～14 min(80∶20)，14～23 min漸變?yōu)?100∶0);檢測波長:200～400 nm;柱溫:35℃;流速:1 mL/min;進樣量:5 μL。

2.2 溶液配制

分別精密稱取氟康唑、灰黃霉素、酮康唑、克霉唑、硝酸益康唑、硝酸咪康唑、鹽酸特比萘芬 10，6，10，6，8，18，18，8 mg，置 5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度;取伊曲康唑，用甲醇－四氫氟喃(4∶1)超聲溶解樣品并定容。稱取前，將氟康唑、克霉唑、硝酸咪康唑?qū)φ掌酚诤嫦渲?05℃干燥2 h，酮康唑?qū)φ掌穭t80℃減壓干燥4 h，其余對照品直接稱取。將以上配制的對照品貯備液各稀釋10倍，即得各化學(xué)藥物的對照品溶液。取對照品貯備液各1 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇定容，即得混合對照品溶液。稱取磷酸二氫鉀約2.0 g，加入1 000 mL超純水溶解，配成0.2%的磷酸二氫鉀，并用0.45 μm的微孔濾膜過濾，即得流動相緩沖鹽溶液。

2.3 方法學(xué)考察

保留時間及響應(yīng)值測定:將上述2.2項下各單個對照品溶液及混合對照品溶液、甲醇空白溶液分別用0.45 μm的微孔濾膜過濾后進樣5 μL，得到色譜圖(圖1)及光譜圖(圖2)?；旌蠈φ掌犯鞣宓姆蛛x度均大于1.5。

圖1 8種對照品溶液的色譜圖

檢測限確定:將2.2項下各單個對照品溶液用甲醇稀釋成一系列由高到低的梯度濃度溶液，在擬訂的色譜條件下分別進樣，以信噪比(S/N)為3計，測得檢測限。結(jié)果見表1，各對照品的檢測限都小于10 ng。

表1 8種對照品溶液的響應(yīng)值及色譜方法評價

重復(fù)性試驗:取混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，測得峰面積，分別計算各種成分的 RSD。結(jié)果表明，各成分 RSD均小于2%，方法精密度高(見表1)。

加樣回收試驗:于平行的3份空白樣品中分別加入一定量的混合對照品溶液，照樣品的處理方法用甲醇定容至10 mL，超聲提取40 min，用0.45 μm的微孔濾膜過濾后進樣，測得峰面積，與相同濃度標(biāo)準(zhǔn)液的峰面積比較，分別計算各成分的平均回收率。除鹽酸特比奈芬平均回收率低于90%外，其他化學(xué)抗真菌藥物均高于90%(見表1)。

圖2 8種對照品溶液的光譜圖

線性關(guān)系考察:將2.2項下混合對照品溶液分別用甲醇稀釋5，10，20，40，80 倍，配制成一系列梯度的對照品溶液，按選定的色譜條件分別進樣，以對照品的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、對照品質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)作回歸計算，得到各對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。結(jié)果見表2。

表2 各對照品溶液的回歸方程與相關(guān)系數(shù)

2.4 樣品含量測定

準(zhǔn)確稱取樣品(軟膏、涂液)1 g，置10 mL比色管中，用甲醇定容后超聲提取40 min，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。取供試品溶液5 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜峰圖。分別取2.2項下8種對照品溶液，同法測定。按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算含量。

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)[3－7]報道，其中部分成分的檢測波長約為210～230 nm。采用DAD檢測器對各成分色譜峰進行掃描，結(jié)果顯示，除硝酸益康唑和硝酸咪康唑在230 nm波長處有最大吸收，其余均在210 nm波長附近有最大吸收，故選擇210 nm作為檢測波長。

試驗開始先使用甲醇－水(80∶20)為流動相，各對照品均能相互分離，但各峰均有不同程度的拖尾，尤其是鹽酸特比萘芬前拖尾很嚴(yán)重，硝酸咪康唑和鹽酸特比萘芬的保留時間較長。故將水換為0.2%的磷酸二氫鉀溶液，且進行梯度洗脫，以改善峰形，調(diào)整保留時間。用甲醇－0.2%磷酸二氫鉀(80∶20)在14 min之前除硝酸咪康唑和鹽酸特比萘芬外其余均出峰，故在14 min時調(diào)整流動相的比例為甲醇－0.2%磷酸二氫鉀(100∶0)。因流動相比例突變導(dǎo)致基線很不平穩(wěn)，故又從14 min到23 min使得流動相比例從80∶20漸變?yōu)?00∶0，使得基線較平穩(wěn)。為了使一針基線平穩(wěn)，則在23.2 min使得流動相比例重新變?yōu)?0∶20，穩(wěn)定至40 min，進下一針。

高效液相色譜法具有分離性能高、分析信息準(zhǔn)確的優(yōu)點，結(jié)合二極管陣列紫外光譜檢測，可進一步對結(jié)果進行判斷。本方法用于檢測中藥制劑中非法添加的抗真菌化學(xué)藥物，分離度好，準(zhǔn)確度較高，重復(fù)性和線性較好，可用于非法添加抗真菌藥物的初篩。本研究僅對有限的幾種抗真菌藥物進行了篩查，因中藥制劑成分復(fù)雜，制劑樣品的處理方式對于減少中藥成分的干擾、有效檢出其中的非法添加物非常重要，針對不同的中藥制劑需優(yōu)化不同的樣品處理方法。

[1]吳春敏，陳海濱.中成藥中非法添加化學(xué)物質(zhì)的現(xiàn)狀與對策[J].海峽藥學(xué)，2003，15(6):107.

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