全麻手術(shù)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞DNA損傷及臨床意義

肖 憬，詹 翔，桑圣剛

應(yīng)激反應(yīng)及繼發(fā)的氧化損傷及炎性反應(yīng)是手術(shù)及麻醉對患者全身性損害的一種形式［1-2］，在手術(shù)過程中，雖然麻醉可以在一定程度減輕疼痛、牽拉等對機(jī)體的不良刺激，但是植物神經(jīng)系統(tǒng)對創(chuàng)傷刺激的反應(yīng)并不能完全被阻斷，機(jī)體仍處于創(chuàng)傷應(yīng)激的狀態(tài)，體內(nèi)耗氧量增加，氧自由基生成增多。組織器官在血流阻斷、牽拉等手術(shù)過程中，不斷發(fā)生組織器官局部的缺血缺氧，在恢復(fù)血液灌注后會發(fā)生非典型的缺血再灌注損傷。氧自由基大量生成，抗氧化系統(tǒng)活性下降，加重對機(jī)體的損傷［3］。本研究觀察76例全麻手術(shù)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)DNA的改變情況，同時(shí)測定患者血液中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)的含量，為手術(shù)過程中加強(qiáng)生命體征監(jiān)測提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2009年9月—2011年12月在海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院手術(shù)室行全麻的手術(shù)患者76例，男43例，女33例;年齡5～65歲。其中胃癌26例，直腸癌15例，肺癌27例，肝破裂3例，腸壞死5例。

1.2 儀器 電泳儀(北京市六一儀器廠DYY-7B型)，熒光顯微鏡(日本尼康E800)，低溫冰箱(青島海爾)，離心機(jī)(安徽科大創(chuàng)新有限公司中佳分公司KDC-1042)，凝膠成像系統(tǒng)(德國 Herolab UVT-28)，彗星圖像分析系統(tǒng)(捷克LUCIATMCOMET)。

1.3 試劑 percoll分離液(美國Ameisco公司)，兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原、FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG熒光抗體(美國ADI公司)，正常熔點(diǎn)瓊脂糖、低熔點(diǎn)瓊脂糖、月桂酰肌氨酸鈉、TritonX-100、Thris-HCl(美國Ameisco公司)，Na2-EDTA、二甲基亞砜、溴化乙錠、胎盼藍(lán)(西安華美公司)，蛋白酶K(德國默克公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.4 方法

1.4.1 麻醉方法:術(shù)前常規(guī)肌內(nèi)注射阿托品0.5 mg、苯巴比妥100 mg。開放靜脈通道，乳酸林格液輸注保持靜脈通道通暢，給予面罩吸氧，依次靜脈注射咪達(dá)唑侖 0.15 ～0.2 mg/kg、芬太尼 0.2 mg、琥珀酰膽堿2 mg/kg誘導(dǎo)，90 s后行氣管插管。氣管插管后機(jī)械通氣，潮氣量為10 ml/kg，呼吸頻率為12/min。吸入1% ～2%異氟醚，靜脈分次推注維庫溴銨(0.05 mg/kg)，微量泵靶控持續(xù)泵入芬太尼維持麻醉。

1.4.2 PBMC提取:采集麻醉日晨空腹、麻醉后1 h及術(shù)后 2 d空腹靜脈血 10 ml，分別置于含0.109 mol/L的枸櫞酸鈉負(fù)壓管中，立即顛倒混勻。用ficoll密度離心法分離PBMC，用RPMI 1640調(diào)細(xì)胞濃度為1×106/L，在光鏡下用臺盼藍(lán)法檢測活細(xì)胞率＞95%，制成細(xì)胞懸液備用。

1.4.3 單細(xì)胞凝膠電泳［4］:45℃下將濃度為10 g/L的正常熔點(diǎn)瓊脂糖150 μl涂在磨砂載玻片上，加蓋玻片輕壓，于4℃凝固10 min制成第一層膠;37℃下將含1000個(gè)細(xì)胞的懸液150 μl與等體積濃度為5 g/L的低熔點(diǎn)瓊脂糖混合均勻，取150 μl滴在第一層膠上，加蓋玻片輕壓，于4℃凝固10 min制成第二層膠;37℃下取濃度為5 g/L的低熔點(diǎn)瓊脂糖100 μl涂在第二層膠上并加蓋玻片輕壓，于4℃凝固10 min制成第三層膠。小心去掉蓋玻片，將包埋了細(xì)胞的載玻片小心放入細(xì)胞裂解液中，置于4℃下1.5 h。取出載玻片，緊密排列于水平電泳槽中，加入電泳緩沖液，4℃解旋20 min。在電壓32 V，電流300 mA，4℃電泳25 min。電泳后小心將載玻片浸于中和液2次，每次15 min。用濃度為20 μg/ml的溴化乙錠染色20 min，加蓋玻片。在熒光顯微鏡(400倍)下觀察，每片計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，用彗星圖像分析系統(tǒng)分析細(xì)胞彗星率和彗尾DNA含量。

1.4.4 SOD、MDA的檢測:按試劑盒說明進(jìn)行操作，應(yīng)用黃嘌呤氧化酶法測定血清SOD活性，硫代巴比妥酸法測定血清MDA濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用方差分析，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果 熒光顯微鏡下觀察到血液中表現(xiàn)為拖尾的熒光圖像的PBMC，呈“彗星”狀，稱彗星率。全麻手術(shù)患者麻醉1 h彗星率及彗尾DNA含量高于麻醉前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，術(shù)后2 d彗星率及彗尾DNA含量與麻醉前比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，與麻醉1 h比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 全麻手術(shù)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞彗星率、彗尾DNA含量(±s，%，n=76)

表1 全麻手術(shù)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞彗星率、彗尾DNA含量(±s，%，n=76)

注:與麻醉前比較，aP ＜0.05;與麻醉1 h比較，cP ＜0.05

含量麻醉前時(shí)間 彗星率 彗尾DNA 28.95 ±2.13 13.16 ±3.43麻醉1 h 64.47 ±6.75a 39.47 ±3.52a術(shù)后2 d 33.62 ±3.27c 14.37 ±4.18c

2.2 SOD、MDA檢測結(jié)果 全麻手術(shù)患者麻醉1 h SOD活性明顯降低，MDA含量顯著增高，與麻醉前比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);術(shù)后2 d SOD活性升高，MDA含量降低，與麻醉前比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，與麻醉1 h比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見表2。

表2 全麻手術(shù)患者外周血中超氧化物歧化酶和丙二醛的含量比較(±s，n=76)

表2 全麻手術(shù)患者外周血中超氧化物歧化酶和丙二醛的含量比較(±s，n=76)

注:與麻醉前比較，aP ＜0.05;與麻醉1 h比較，cP ＜0.05

時(shí)間 超氧化物歧化酶(U/L) 丙二醛(μmol/L)麻醉前105.0 ±11.2 15.2 ±5.7麻醉 1 h 45.0 ±9.3a 141.3 ±28.7a術(shù)后 2 d 98.4 ±10.7c 14.7 ±6.3c

3 討論

全麻手術(shù)中可因呼吸、循環(huán)功能紊亂而引起機(jī)體缺氧性損傷，產(chǎn)生大量氧自由基［5］。氧自由基是強(qiáng)烈的DNA斷裂劑［6］，可直接攻擊DNA，導(dǎo)致DNA單、雙鏈斷裂，并呈量－效及時(shí)－效關(guān)系［7］。

本研究應(yīng)用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)檢測外周血PBMC DNA損傷情況，在電場力的作用下，受損PBMC細(xì)胞核中帶陰電荷的DNA斷片在凝膠分子篩中向陽極移動(dòng)，形成“彗星”狀圖像，DNA鏈缺口越多，進(jìn)入尾部的DNA越多，表現(xiàn)為尾長增加，未損傷細(xì)胞在電泳中DNA仍停留于核中形成圓形熒光團(tuán)。計(jì)數(shù)細(xì)胞彗星率和彗尾的熒光強(qiáng)度可以定量反映群體細(xì)胞中DNA鏈斷裂損傷程度［8-9］。電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)全麻手術(shù)患者麻醉1 h彗星率及彗尾DNA含量高于麻醉前，術(shù)后2 d彗星率及彗尾DNA含量低于麻醉1 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與麻醉前相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示在全麻狀態(tài)下，患者存在一定程度的缺氧情況。這與Jugdutt［10］的觀點(diǎn)一致。分析原因可能是全麻狀態(tài)下一定程度的缺氧觸發(fā)了氧自由基的釋放，引起PBMC損傷的瀑布樣反應(yīng)，使一氧化氮合酶和一氧化氮含量下降，嗜中性粒細(xì)胞活化，細(xì)胞因子增多并產(chǎn)生更多的氧自由基，進(jìn)一步加重PBMC的損傷;氧自由基大量產(chǎn)生，外周血抗氧化能力下降，導(dǎo)致氧化性DNA損傷、斷裂［11］。

SOD能夠清除氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞，間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力;MDA為氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸形成的脂質(zhì)過氧化分解產(chǎn)物，其含量的變化可反映出組織細(xì)胞氧化損傷的程度［12］。這兩個(gè)指標(biāo)反映了體內(nèi)自由基的氧化和抗自由基的水平。本研究表明，全麻手術(shù)患者麻醉1 h SOD活性明顯降低，MDA的含量顯著增高，與麻醉前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;術(shù)后2 d SOD活性明顯升高，MDA顯著降低，與麻醉前相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與麻醉1 h相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與國內(nèi)研究相一致［13-14］。結(jié)合PBMC DNA的損傷情況，分析原因?yàn)?全麻患者在手術(shù)過程中，除了手術(shù)本身的影響外，患者本身存在一定程度的缺氧。缺氧的程度與PBMC DNA的損傷程度、SOD的下降程度及MDA的升高水平相一致［15］。因此，在手術(shù)過程中如何糾正患者的缺氧，對減少患者手術(shù)過程氧自由基的產(chǎn)生至關(guān)重要。

總之，全麻患者在手術(shù)過程中存在不同程度的缺氧，極易引發(fā)患者體內(nèi)氧自由基的大量蓄積，可導(dǎo)致其他并發(fā)癥的發(fā)生，故對于全麻手術(shù)患者在手術(shù)過程中早期監(jiān)測單個(gè)核細(xì)胞DNA的變化情況可能有利于預(yù)防缺氧，對提高手術(shù)質(zhì)量具有指導(dǎo)意義。

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