不同材料誘導(dǎo)犬根尖形成的比較研究

黃銳 劉鵬 肖茂德等

[摘要] 目的 比較羥磷灰石（HA）、氫氧化鈣（CH）、Vitapex誘導(dǎo)犬年輕恒牙根尖形成的效果。方法 選用2只5～6月齡犬的16顆恒切牙，去髓后隨機(jī)分為4組。A、B、C組為實(shí)驗(yàn)組，依次用HA、CH及Vitapex糊劑充填根管；D組為對(duì)照組，用AH plus糊劑充填。采用錐形束CT（CBCT）測(cè)量牙根長(zhǎng)度及根尖面積的變化；制作石蠟切片行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察根尖組織形態(tài)；制作冰凍切片行堿性磷酸酶（ALP）染色，觀察細(xì)胞的成骨活性。結(jié)果 1）CBCT結(jié)果顯示：術(shù)后4周，各組牙根均較術(shù)前延長(zhǎng)（P<0.05），3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的根尖面積較術(shù)前縮?。≒<0.05）；術(shù)后8周，各組根尖均顯示高密度閉合影像。2）組織切片顯示：各組根尖均無(wú)炎癥反應(yīng)；術(shù)后4周，根尖均未閉合，但有牙骨質(zhì)及牙周膜伸入根管；術(shù)后8周，A組根尖被完整的牙骨質(zhì)屏障封閉，ALP陽(yáng)性細(xì)胞分布集中，B、C組牙骨質(zhì)屏障內(nèi)有間隙，牙周膜伸入其中，ALP陽(yáng)性細(xì)胞散在分布，D組根尖仍有稀疏牙骨質(zhì)和類牙骨質(zhì)沉積，并有纖維及血管組織增生，ALP陽(yáng)性細(xì)胞不明顯。結(jié)論 經(jīng)去髓后的年輕恒牙在無(wú)感染時(shí)牙根能繼續(xù)發(fā)育，牙周膜可能是其發(fā)育的組織來(lái)源；HA誘導(dǎo)根尖形成的速度較快，是一種理想的根尖誘導(dǎo)材料。

[關(guān)鍵詞] 根尖誘導(dǎo)； 錐形束CT； 羥磷灰石； 堿性磷酸酶； 牙周膜

[中圖分類號(hào)] R 781.34 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.04.012

年輕恒牙的牙根在牙髓感染或根尖感染后可停止發(fā)育。根尖誘導(dǎo)成形術(shù)是在消除感染的基礎(chǔ)上，用藥物誘導(dǎo)根尖周硬組織形成并使牙根繼續(xù)發(fā)育的方法[1]，而尋找理想的誘導(dǎo)藥物則是人們一直研究

的課題。堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）是牙齒、骨等硬組織形成、再生的重要礦化酶，其活性強(qiáng)弱反應(yīng)了組織的成骨能力[2]，而冰凍切片ALP染色是觀察組織中ALP活性的經(jīng)典方法。本研究擬通過(guò)錐形束CT（cone beam CT，CBCT）影像學(xué)觀察、組織形態(tài)學(xué)及酶組織化學(xué)等方法對(duì)比幾種常見(jiàn)根尖誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)犬根尖形成的效果，探討牙根繼續(xù)發(fā)育的可能機(jī)制，為臨床根尖誘導(dǎo)成形術(shù)中選用有效的藥物提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要設(shè)備及材料

KaVo 3D-eXam型CBCT；納米級(jí)羥磷灰石（hy-droxyapatite，HA）粉劑（AMRESCO公司，美國(guó)），甘油（分析純，鄭州化工試劑二廠），氫氧化鈣（calcium

hydroxide，CH）糊劑（含散劑和液劑，湖北泰辰健瑞藥業(yè)有限公司），Vitapex糊劑（日本森田株式會(huì)社），AH plus糊劑（Densply公司，美國(guó)）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5～6月齡健康雜種犬2只（由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)中心提供），分別命名為甲、乙犬，雌雄各1只，體重分別為6.8、7.2 kg。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)用糊劑的制備 HA：納米級(jí)HA粉劑和甘油按等體積比混合調(diào)成糊狀；CH、Vitapex、AH plus糊劑等按廠家說(shuō)明使用。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理 1）術(shù)前觀察：甲、乙犬分別拍攝CBCT片，證實(shí)兩只犬共16顆恒切牙根尖均未發(fā)育完全，測(cè)量牙根長(zhǎng)度及根尖面積。2）根管預(yù)備及充填：用速眠新Ⅱ按0.1 mL·kg-1肌注麻醉動(dòng)物，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%氯己定沖洗口腔，將16顆恒切牙進(jìn)行根管預(yù)備，然后隨機(jī)分成A、B、C、D共4組，分別充填HA、CH、Vitapex、AH plus，最后用玻璃離子水門汀充填。3）甲犬的術(shù)后處理：術(shù)后4周拍攝CBCT片，測(cè)量牙根長(zhǎng)度及根尖面積，隨即麻醉下處死，取實(shí)驗(yàn)區(qū)域牙及頜骨，經(jīng)4 ℃固定、脫鈣、脫水、包埋后以根尖孔為中心制作石蠟連續(xù)切片，行蘇木精-伊紅（hematine-eosin，HE）染色。4）乙犬的術(shù)后處

理：分別于術(shù)后4、8周拍攝CBCT片，測(cè)量術(shù)后4周牙根的長(zhǎng)度及根尖面積；術(shù)后8周處死動(dòng)物，4個(gè)標(biāo)本按甲犬的處理方法制片行HE染色，另外4個(gè)標(biāo)本按杜卓民法[3]制作冰凍切片行ALP染色。

1.4 觀察方法及內(nèi)容

1.4.1 CBCT影像學(xué)觀察 采用掃描的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行三維重建，獲得實(shí)驗(yàn)牙區(qū)域多層面的軸位、矢狀位及冠狀位圖像。以右上頜中切牙為例（圖1），分別調(diào)

節(jié)其軸位、矢狀位及冠狀位的x、y坐標(biāo)軸，其交點(diǎn)O為根尖位置，從矢狀位測(cè)量牙根長(zhǎng)度，并在根尖處沿與牙根長(zhǎng)軸垂直的方向做切面，獲得根尖部位的橫斷面形態(tài)，利用軟件中的亨氏單位（hounsfield unit，HU）統(tǒng)計(jì)功能，從橫斷面測(cè)量根尖面積。

1.4.2 組織學(xué)觀察 各組的HE染色樣本用于觀察根尖大體形態(tài)及根尖區(qū)細(xì)胞的組成及分布，ALP染色樣本用于觀察根尖周區(qū)域ALP陽(yáng)性細(xì)胞（細(xì)胞呈黑色染色）的分布情況。所有樣本均在普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)量3次，記錄其平均值，采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)方法采用單側(cè)配對(duì)t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CBCT觀察結(jié)果

4組牙齒術(shù)前和術(shù)后4周的牙根長(zhǎng)度和根尖面積見(jiàn)表1。術(shù)后4周，4組牙齒的根尖孔均未閉合（圖2），

但牙根長(zhǎng)度與術(shù)前相比，其變化均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<

0.05）。A、B、C組根尖面積的變化與術(shù)前相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而D組根尖面積的變化則無(wú)統(tǒng)計(jì)

學(xué)意義（P>0.05）。術(shù)后8周，因甲犬已處死，樣本量

較小，測(cè)量數(shù)據(jù)未行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，但各組根尖橫斷面均顯示有密度較高的閉合影像（圖2），其中A組與B組、C組與D組的根尖幾乎分別位于同一橫斷面上，為描述方便，將A組與B組、C組與D組根尖橫斷面影像分別合并描述。結(jié)果提示，AH plus組的根尖閉合速度慢于其余3組。

2.2 組織切片觀察結(jié)果

4組牙齒的組織切片染色結(jié)果見(jiàn)圖3～5。術(shù)后4周，各組根尖孔均未閉合，但有牙骨質(zhì)及牙周膜伸入根管內(nèi)，僅A、B、C組可見(jiàn)活躍的成骨細(xì)胞及新生骨組織。術(shù)后8周，A組根尖孔封閉，根管腔和牙周膜被牙骨質(zhì)屏障隔絕，牙周膜中ALP陽(yáng)性細(xì)胞呈帶狀集中分布；B、C組牙骨質(zhì)屏障內(nèi)有間隙，牙骨質(zhì)邊緣仍有成牙骨質(zhì)細(xì)胞增生，牙周膜伸入其中，并有纖維及血管組織增生，ALP陽(yáng)性細(xì)胞呈散在分布；D組根尖有稀疏的牙骨質(zhì)、部分未礦化完全的類牙骨質(zhì)沉積及纖維、血管組織增生，其間仍有成牙骨質(zhì)細(xì)胞，ALP陽(yáng)性細(xì)胞不明顯。另外，各組均未見(jiàn)炎癥細(xì)胞。根據(jù)組織切片觀察結(jié)果，可以認(rèn)為HA組根尖閉合速度最快，且與成骨相關(guān)的細(xì)胞分布較為集中。

3 討論

近年來(lái)，有學(xué)者在牙周膜組織中鑒定出了干細(xì)胞，即牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cell，PDLSC），具有分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞，成骨細(xì)胞以及分泌骨、牙骨質(zhì)、牙周膜樣組織的能力，能發(fā)揮生理性細(xì)胞更新和修復(fù)組織損傷的作用[4]。牙周膜干細(xì)

胞巢（periodontal ligament stem cell niche，PDLSCN）是PDLSC周圍的微環(huán)境，由支持細(xì)胞、基質(zhì)及生長(zhǎng)因子等組成。生理情況下，PDLSCN中各種成分處于相對(duì)平衡穩(wěn)定的狀態(tài)，能很好地調(diào)控PDLSC的功能，但PDLSCN受到某種因素影響致使各種成分平衡打破或出現(xiàn)功能失調(diào)時(shí)，則會(huì)嚴(yán)重影響PDLSC的分化功能[5]。

從本實(shí)驗(yàn)組織切片可觀察到，根尖區(qū)牙周膜可向根管腔內(nèi)遷移并逐漸形成牙骨質(zhì)結(jié)構(gòu)以封閉根尖，未完全封閉的根尖可見(jiàn)大量纖維，推測(cè)牙周膜中的PDLSC在某種調(diào)控下分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而形成牙骨質(zhì)；同時(shí)，牙周膜中的纖維也能礦化形成類牙骨質(zhì)結(jié)構(gòu)而封閉根尖孔。4種材料誘導(dǎo)根尖孔閉合的速度以HA最快，AH plus最慢，造成這種差異可能是不同材料誘導(dǎo)硬組織形成的能力及對(duì)PDLSC向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的過(guò)程產(chǎn)生了不同的影響所致。

不同的材料為與之接觸的各種細(xì)胞提供了不同的細(xì)胞外基質(zhì)，從而提供了不同的刺激信號(hào)，引起細(xì)胞不同的黏附、生長(zhǎng)及分化等功能，表現(xiàn)為細(xì)胞相容性的差異，對(duì)材料生物功能的發(fā)揮起到了重要作用[6]。

HA是牙齒的主要無(wú)機(jī)成分，是一種細(xì)胞相容性很好的材料，具有傳導(dǎo)成骨特性[6]。盧曉風(fēng)等[7]研究證實(shí)，成骨細(xì)胞能在HA/磷酸三鈣（tricalcium phos-phate，TCP）支架上很好地貼附生長(zhǎng)，并具有較強(qiáng)的ALP活性及形成礦化的細(xì)胞外基質(zhì)等成骨表型。有學(xué)者[8]在納米HA誘導(dǎo)人牙周膜細(xì)胞ALP表達(dá)的研究

中發(fā)現(xiàn)，納米HA與致密HA相比，具有促進(jìn)細(xì)胞在增殖早期向骨化亞群分化的作用。本研究中，HA組根尖形成最快，ALP陽(yáng)性細(xì)胞分布集中，一方面是由于使用流動(dòng)性較好的甘油作為溶劑，HA能在局部均勻擴(kuò)散；另一方面，HA良好的細(xì)胞相容性能聚集更多的PDLSC及成骨相關(guān)細(xì)胞，其良好的傳導(dǎo)成骨性也可使局部硬組織加快形成。

CH和Vitapex的作用機(jī)制相似，其誘導(dǎo)硬組織形成依賴局部Ca2+和OH-的濃度[9]，故其促進(jìn)礦化的作

用受到其溶解度的限制；另外，有研究[10]表明，CH解離出的OH-可改變細(xì)胞器和酶，影響細(xì)胞分裂，這可能影響本研究中CH、Vitapex組PDLSCN中細(xì)胞的生理功能，從而影響其誘導(dǎo)根尖形成的效果。

AH plus糊劑為樹脂類根管封閉劑的代表，可揮發(fā)甲醛而具有較弱的抗菌性和細(xì)胞毒性。有研究[11]發(fā)現(xiàn)，0.1%的AH plus能導(dǎo)致肝細(xì)胞表面損傷甚至細(xì)胞死亡。本實(shí)驗(yàn)中AH plus組根尖閉合速度最慢，可能因其細(xì)胞毒性破壞了PDLSCN對(duì)PDLSC的調(diào)節(jié)，從而延緩了該組根尖的閉合。

綜上所述，在適當(dāng)誘導(dǎo)條件下，牙周膜組織可分化形成牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)封閉根尖，其效果可能主要與PDLSCN微環(huán)境密切相關(guān)，其中HA作為一種理想的新骨形成的生理基質(zhì)能較好地促進(jìn)根尖的繼續(xù)發(fā)育，可為臨床治療提供參考。

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（本文編輯 吳愛(ài)華）