壓應(yīng)力對小鼠單核細胞RAW264.7 DNAX活化蛋白12、抗酒石酸酸性磷酸酶表達的影響

黃生高 凌天牖 鐘孝歡等

[摘要] 目的 探討壓應(yīng)力對小鼠單核細胞RAW264.7 DNAX活化蛋白12（DAP12）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）表

達的影響。方法 以小鼠單核細胞RAW264.7為研究對象，采用四點彎曲體外細胞加載裝置加載壓應(yīng)力0、3、6、12 h，分別以逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、蛋白免疫印跡法檢測DAP12、TRAP mRNA和DAP12蛋白的表達情況。結(jié)果

小鼠單核細胞RAW264.7經(jīng)破骨細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)后，體積變大，核數(shù)目增多，TRAP染色陽性。受壓應(yīng)力刺激后，DAP12、TRAP mRNA及DAP12蛋白表達隨加力時間延長而增加（P<0.05）。結(jié)論 小鼠單核細胞RAW264.7經(jīng)破骨細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)后成功向破骨細胞轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化細胞受壓應(yīng)力刺激活化過程中存在DAP12高表達。

[關(guān)鍵詞] DNAX活化蛋白12； 抗酒石酸酸性磷酸酶； 壓應(yīng)力； 破骨細胞

[中圖分類號] Q 78 [文獻標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.04.008

破骨細胞由其前體細胞分化而來，在其分化并行使功能的過程中受多條信號傳導(dǎo)通路調(diào)控。其中免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）信號傳導(dǎo)通路日益受到人們的重視。已知DNAX活化蛋白12（DNAX-activa-ting protein 12，DAP12）是骨髓來源細胞系ITAM的主要銜接蛋白，在ITAM信號通路中起著樞紐作用。但其在破骨細胞受機械力刺激后的表達及作用尚不清楚。本實驗擬探討在小鼠單核細胞株RAW264.7受壓應(yīng)力的刺激后，DAP12、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）mRNA及DAP12蛋白的表達情況，為進一步研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠單核細胞株RAW264.7（ATCC公司，美國），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司），兔抗人

DAP12多克隆抗體、羊抗人β-actin多克隆抗體、辣根過氧化酶HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG（Santa Cruz公司，

美國），小鼠重組可溶性核因子κB受體活化因子配基（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，

RANKL）、巨噬細胞集落刺激因子（macrophage co-

lony-stimulating factor，M-CSF）（Peprotech公司，美國），TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaKaRa TaqTM PCR

試劑套裝、高糖DMEM培養(yǎng)基（Invitrogen公司，美

國），TRAP染色試劑盒（Sigma公司，美國），BCA蛋白定量試劑盒（Pierce公司，美國），聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）（Millipore公司，美國）等。

1.2 主要設(shè)備

SFEG AIR超凈工作臺（蘇州蘇凈公司），四點

彎曲體外細胞加載裝置（四川大學(xué)設(shè)計，專利號：

zL01256849.x），F(xiàn)orma Scientific CO2培養(yǎng)箱（Shellab公司，美國），Olympus IX50相差倒置顯微鏡（Oly-mpus公司，日本），Nikon YS100光學(xué)顯微鏡（Nikon公司，日本），DU530紫外分光光度計（Backman公

司，美國），PCR system 2700型PCR擴增儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），DYY-Ⅱ、DYY-Ⅲ型凝膠電泳儀（北京六一儀器廠），GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)

（Bio-Rad公司，美國）等。

1.3 細胞分組和加力

1.3.1 加力板的準備 將750 mL斜頸培養(yǎng)瓶從中間剖開，取細胞培養(yǎng)常用的底面，打磨成8.0 cm×3.0 cm大小的兩塊，周緣平滑四角圓鈍，以避免加力過程中的應(yīng)力集中。使用清水洗凈加力板，放入酸性洗液中過夜后用三蒸水反復(fù)沖洗數(shù)次，再放入75%乙醇中浸泡24 h，三蒸水浸泡12 h后在56 ℃烘箱中烤干，最后在超凈工作臺紫外消毒燈下雙面照射滅菌（各12 h）后接種細胞。

1.3.2 加力前細胞的準備 將常規(guī)傳代后的RAW-264.7細胞以密度為每毫升1×104個接種于加力板上（實驗組和對照組同時種板）。加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1 d后細胞絕大部分貼壁，更換為破骨細胞培養(yǎng)液（DMEM全培養(yǎng)液含20 ng·mL-1的M-CSF和50 ng·mL-1的RANKL），繼續(xù)培養(yǎng)6 d。

1.3.3 細胞加力 采用四點彎曲體外細胞加載裝置對接種在加力板上的RAW264.7細胞進行壓應(yīng)力刺激。本實驗設(shè)實驗組與對照組，實驗組使用的壓應(yīng)力頻率為0.5 Hz，大小為2 500 μtrain，在0、3、6、12 h不同時間段，使細胞在平行于貼壁方向上發(fā)生單軸壓縮應(yīng)變；對照組不加力。對照組和實驗組各包含3個實驗樣本，每組的3個樣本均來自同一瓶計數(shù)的細胞，以相同的細胞密度和細胞量接種在加力板上。除加力時間與是否加力影響因素外，其他條件基本一致。加力結(jié)束后分別收獲細胞，進行后續(xù)相關(guān)實驗。

1.4 半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcrip-

tion-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測

DAP12、TRAP mRNA的表達

1.4.1 細胞總RNA的提取及純度測定 按照TRIzol試劑盒說明提取細胞總RNA。

1.4.2 逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA第一鏈 取1 μg總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄，生成20 μL cDNA第一鏈。

1.4.3 PCR擴增 實驗引物序列具體如下。DAP12上游引物序列：5-GGCTGGGATTGTTCTGGGTGAC-3，下游引物序列：5-CCGCTGATGGGCATAGAG-TGG-3。TRAP上游引物序列：5-ACACAGTGAT-GCTGTGTGGCAACTC-3，下游引物序列：5-CC-AGAGGCTTCCACATATATGATGG-3。GAPDH上游引物序列：5-AAGCCCATCACCATCTTCCA-3，下游引物序列：5-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3。

按照TaKaRa TaqTM PCR試劑盒說明生成20 μL PCR產(chǎn)物。PCR擴增條件如下。DAP12：94 ℃預(yù)變性5 min，開始循環(huán)94 ℃ 20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸25 s，共35個循環(huán)，72 ℃徹底延伸10 min，4 ℃保存。TRAP：94 ℃預(yù)變性5 min，開始循環(huán)94 ℃ 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸25 s，共35個循環(huán)，72 ℃徹底延伸10 min，4 ℃保存。GAPDH：95 ℃預(yù)變性

5 min，開始循環(huán)95 ℃ 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)，72 ℃徹底延伸10 min，4 ℃保存。

1.4.4 PCR產(chǎn)物凝膠電泳 各取20 μL PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠上電泳（電壓100 V），凝膠成像系

統(tǒng)照相并用Quantity one-4.0.3凝膠圖像分析軟件測量其積分光密度值（integral optical density value，

IOD）。分別計算DAP12 mRNA、TRAP mRNA與GAPDH mRNA RT-PCR產(chǎn)物電泳帶IOD值之比。

1.5 蛋白免疫印跡法檢測DAP12蛋白的表達

首先應(yīng)根據(jù)欲分離的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大小選擇適合的凝膠濃度。本研究分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為4%。常規(guī)提取蛋白質(zhì)，并測定濃度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。實驗結(jié)果以mean±SD表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠單核細胞RAW264.7的培養(yǎng)及其向破骨細

胞分化

體外培養(yǎng)的小鼠單核細胞RAW264.7在10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中生長良好。以密度為每毫升1×104個進行接種，2～12 h細胞貼壁，5～6 d細胞長滿培養(yǎng)瓶。倒置顯微鏡下可見培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的貼壁RAW264.7細胞大多數(shù)呈類圓形，少量細胞呈不規(guī)則形態(tài)，有偽足，一般含1～2個細胞核（圖1）。加入破骨細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)4 d后，可見多核細胞，胞內(nèi)有3～7個核，細胞大小不一，形態(tài)各異，TRAP染色陽性；培養(yǎng)第7天，TRAP染色陽性多核細胞增多，體積增大，核數(shù)目增多，表明RAW264.7細胞向破骨細胞轉(zhuǎn)化（圖2）。

2.2 力刺激對RAW264.7細胞DAP12、TRAP mRNA

表達的影響

2.2.1 RNA純度和電泳結(jié)果 采用紫外分光光度計測量RNA的純度，A260 nm/A280 nm比值均在1.7～2.0，顯示RNA的純度較高。瓊脂糖凝膠電泳顯示28S、18S和5S 3條帶，無明顯雜帶（圖3）。

2.2.2 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果 受壓應(yīng)力刺激后，實驗組DAP12、TRAP mRNA表達隨加力時間延長而逐漸增加，對照組無明顯變化（圖4）。隨著壓應(yīng)力刺

激時間的延長，RAW264.7細胞DAP12 mRNA表達逐漸增加，3 h時增加不明顯，6 h后開始顯著增加。實驗組加力6、12 h與加力0 h比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；加力6、12 h，實驗組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖5）。刺激3 h后TRAP mRNA表達雖然輕微上調(diào)，但無顯著差別，隨著壓應(yīng)力刺激時間的延長，TRAP mRNA表達逐漸升高（6、12 h）。實驗組加力6、12 h與0 h比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），加力6、12 h，實驗組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖6）。

2.3 壓應(yīng)力刺激對RAW264.7細胞DAP12蛋白表達

的影響

壓應(yīng)力刺激RAW264.7細胞3 h后，DAP12蛋白表達水平增加并不明顯，隨著壓應(yīng)力刺激時間的延長（6、12 h），DAP12蛋白表達水平逐漸增高。實驗組加力6、12 h與0 h比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<

0.05），加力6、12 h，實驗組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖7、8）。

3 討論

3.1 細胞和應(yīng)力加載裝置的選擇

體外培養(yǎng)原代的破骨細胞難度很大，成功率較低。小鼠單核細胞RAW264.7在適宜濃度的破骨細胞培養(yǎng)液作用下，可分化成多核的、TRAP染色陽性的、具有骨吸收功能的破骨細胞。重復(fù)性好，結(jié)果穩(wěn)定[1-2]。本實驗參考國內(nèi)外學(xué)者的培養(yǎng)經(jīng)驗，采用20 ng·mL-1的M-CSF和50 ng·mL-1的RANKL聯(lián)合培養(yǎng)RAW264.7細胞，可誘導(dǎo)其向破骨細胞分化，能較好地滿足實驗對細胞量要求較大，且細胞貼壁良好，符合實驗中需加力的要求。

人體日常活動引起骨骼細胞的應(yīng)變約為400～

2 000 μstrain，而在劇烈活動時細胞的應(yīng)變約為

4 000 μstrain[3]。本實驗采用2 500 μstrain的應(yīng)變符合體內(nèi)細胞的生理應(yīng)變范圍。除了應(yīng)變大小之外，機械外力刺激的頻率也可對骨骼細胞產(chǎn)生影響[4-5]，本實驗采用0.5 Hz頻率的壓應(yīng)力可盡量的減少加力過程中培養(yǎng)液對細胞產(chǎn)生的流體剪切力[2]。四點彎曲細胞力學(xué)加載儀采用梁變形原理，利用數(shù)控步進電機使細胞培養(yǎng)板發(fā)生應(yīng)變，使貼附在培養(yǎng)板上的細胞產(chǎn)生形變，從而間接地對細胞產(chǎn)生精確、恒定的單軸應(yīng)力?？蓾M足多種應(yīng)變需求，是一種可靠且重復(fù)性較高的細胞體外力學(xué)加載儀。而且該裝置是通過細胞加力板細胞培養(yǎng)面面積的改變而對其表面培養(yǎng)的細胞進行擠壓，故與其他一些加力裝置相比更能模擬體內(nèi)壓力側(cè)牙槽骨破骨細胞的受力情況。

3.2 壓應(yīng)力刺激對破骨細胞分化的影響

TRAP是破骨細胞特有的標(biāo)志酶，是破骨細胞分化的標(biāo)記物，也與破骨細胞骨吸收功能密切相關(guān)[6-7]。

檢測TRAP的表達情況可反映RAW264.7細胞的功能狀態(tài)。

本研究發(fā)現(xiàn)：在RANKL和M-CSF聯(lián)合作用下，壓應(yīng)力刺激可提高RAW264.7的破骨細胞特征，而對照組這種變化并不明顯。機械外力的這種誘導(dǎo)能力與其對細胞刺激的時間長短有關(guān)，刺激時間過短，并不能引起破骨細胞的高度活化，只有機械外力刺激一定的時間后破骨細胞的活化才變得更加明顯。這與臨床上正畸牙的移動情況有些相似，短暫的力學(xué)刺激（咬合力或短暫的正畸力等）作用于牙齒并不能引起牙齒的移動，只有持續(xù)的正畸力才能引起牙齒移動。

3.3 壓應(yīng)力刺激對RAW264.7細胞DAP12 mRNA和

蛋白表達的變化

破骨細胞來源于骨髓造血系統(tǒng)的單核細胞系，破骨細胞的分化與成骨細胞密切相關(guān)。成骨細胞可表達RANKL，通過細胞間接觸與破骨前體細胞胞膜上的RANK受體結(jié)合，激活RANK介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路來誘導(dǎo)破骨前體細胞向破骨細胞分化[8]。近年來

的研究表明破骨細胞的分化除了要激活與RANKL和 M-CSF相對應(yīng)的細胞膜受體及相對應(yīng)的細胞內(nèi)信號通路外，還需要其他的信號通路參與調(diào)節(jié)[9-10]。ITAM

信號傳導(dǎo)通路在骨代謝平衡或病理性骨改建（像炎

癥性骨吸收等）過程中起重要調(diào)節(jié)作用。DAP12作為ITAM信號傳導(dǎo)通路的一種主要銜接蛋白，其介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路在破骨細胞分化過程中發(fā)揮重要作用。正畸牙移動是個炎癥反應(yīng)過程[11]，這可能引起局部

的免疫反應(yīng)。DAP12介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路作為在炎癥性骨吸收過程中發(fā)揮重要作用的信號通路是否也參與調(diào)節(jié)正畸移動過程中牙槽骨的改建和調(diào)節(jié)機械力誘導(dǎo)破骨細胞分化，目前尚未清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)壓應(yīng)力在刺激RAW264.7細胞后，DAP12 mRNA表達隨著壓應(yīng)力刺激時間的延長逐漸增加。表明DAP12可能參與了破骨細胞對機械力刺激的應(yīng)答反應(yīng)。如前所述，2 500 μtrain的壓應(yīng)力隨著作用時間的增加可逐步上調(diào)破骨細胞分化標(biāo)記物TRAP mRNA的表達，這與DAP12 mRNA表達的趨勢類似，故筆者推測DAP12可能參與調(diào)節(jié)機械壓應(yīng)力誘導(dǎo)RAW264.7細胞的破骨細胞表征的過程。mRNA是從轉(zhuǎn)錄水平進行研究，它并不能完全體現(xiàn)蛋白質(zhì)的表達水平。蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，對蛋白質(zhì)的研究更能闡明各種生理或病理條件下生命現(xiàn)象的變化機制。本實驗發(fā)現(xiàn)在受到壓應(yīng)力刺激3 h后，DAP12蛋白表達水平增加并不明顯；隨著壓應(yīng)力刺激時間的延長（6、12 h），DAP12蛋白表達水平逐漸增高。這與mRNA的變化基本相似。綜上所述，受到壓應(yīng)力刺激后，RAW264.7細胞DAP12 mRNA和蛋白表達發(fā)生改變，提示DAP12參與調(diào)節(jié)機械力學(xué)刺激誘導(dǎo)破骨細胞的分化。

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（本文編輯 杜冰）