陜南薇菜中黃酮類化合物的提取及其抗氧化性研究

袁 亮，李開龍，溫松成，劉 歡，夏發(fā)軍，楊海濤

(陜西理工學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中 723000)

薇菜是紫萁科多年生草本蕨類植物，其嫩葉含蛋白質(zhì)、碳水化合物及鈣、磷等多種成分，其中的黃酮類化合物是廣泛存在于自然界的一大類多苯環(huán)化合物，主要成分蘆丁在生物體內(nèi)具有抗癌、抗菌、抗炎、抗過敏、抗血管脆性和血小板聚集及抗糖尿病并發(fā)癥等多種生理活性及藥理作用。此外，黃酮具有抗氧化作用，可以增強(qiáng)肝細(xì)胞抗氧化酶活性，穩(wěn)定線粒體膜電位，減少活性氧產(chǎn)生，其毒性遠(yuǎn)低于合成氧化劑［1］。調(diào)查顯示:薇菜總黃酮還原能力較強(qiáng)，可以清除 O2－·、·OH 和 DPPH·自由基，且對脂質(zhì)過氧化的抑制活性較強(qiáng)［2］。本實(shí)驗(yàn)將通過正交試驗(yàn)的方法，探究薇菜中黃酮類化合物提取的最佳工藝，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 試材

新鮮的薇菜，采自陜西省南鄭縣漢山鎮(zhèn)，自然風(fēng)干后粉碎，過50目篩，于50℃烘箱干燥至恒重后備用。

1．1．2 主要試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品(自制)。

無水乙醇、可溶性淀粉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、硫代硫酸鈉、碘化鉀、硫酸、過氧化氫等均為分析純。

1．1．3 主要儀器

722-E型紫外可見分光光度計(jì)(上海天普分析儀器有限公司)，F(xiàn)A-2004型電子分析天平(上海方瑞儀器有限公司)，DL-5型低速大容量離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司)，JH-9052型恒溫箱(中國重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)，HH-Z型恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器公司)和SHZ-Ⅲ型真空泵(西安明克斯檢測設(shè)備有限公司)。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 薇菜中黃酮類化合物的提取流程

根據(jù)相似相溶的原理，把在乙醇中溶解度較大的黃酮類化合物從薇菜中分離出來，再利用離心分離祛除色素、蛋白質(zhì)、膠體等大分子物質(zhì)，其工藝流程如下:薇菜→烘箱烘干→碾碎→稱取適量→于恒溫水浴浸提→過濾→離心→定容→取上清液→測定吸光度［3］。

1．2．2 薇菜中黃酮類化合物的提取

取2.5 g薇菜干粉，在溫度、乙醇濃度以及料液比不同的情況下進(jìn)行恒溫水浴，提取一段時(shí)間后過濾，所得溶液經(jīng)離心后，用50 mL的容量瓶進(jìn)行定容。

1．2．3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取經(jīng)干燥至恒重蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg，加乙醇溶解并定容至50 mL，配成0.4 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00 mL，分別加乙醇補(bǔ)至10.00 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1.5 mL，搖勻，靜置6 min，加10%的硝酸鋁溶液1.5 mL，搖勻，靜置6 min，加4%的氫氧化鈉溶液15 mL，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15 min，在波長510 nm處測定吸光度，以蘆丁濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程為:A=10.618C －0.0036，r=0.9952。

1．2．4 薇菜樣品總黃酮含量的測定

采用 NaNO2-Al(NO3)3比色法［4］，在 510 nm 處測定。

1．2．5 單因素實(shí)驗(yàn)

設(shè)計(jì)溫度、浸提時(shí)間、乙醇濃度、料液比4個(gè)因素，分別進(jìn)行3個(gè)水平的單因素實(shí)驗(yàn)，確定最佳提取條件。

1．2．6 正交試驗(yàn)

參照單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)4個(gè)因素3個(gè)水平的正交試驗(yàn)，研究最佳提取工藝，見表1。

表1 正交試驗(yàn)的因素水平

1．2．7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

稱取樣品薇菜粉末3份，每份2.50 g，按最優(yōu)工藝條件進(jìn)行總黃酮提取的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測定和計(jì)算黃酮的得率。

1．2．8 抗氧化性實(shí)驗(yàn)

抗氧化值(artillery observation vehicle，AOV)的測定:利用過氧化氫與碘化鉀反應(yīng)生成碘，再用硫代硫酸鈉滴定碘，設(shè)置空白對照就可以直接測定黃酮類化合物的抗氧化值。分別取不同濃度的薇菜黃酮提取液10 mL于三角瓶中，加入1 mol/L的硫酸0.25 ml和0.25 mol/L的H2O25 mL，室溫下反應(yīng)10 min，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的碘化鉀溶液20 mL，靜置5 min后，用0.05 mol/L硫代硫酸鈉溶液進(jìn)行滴定，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%淀粉溶液指示終點(diǎn)，同時(shí)用空白做對照，平行做三組，測定其平均值［5］。

2 結(jié)果與分析

2．1 單因素實(shí)驗(yàn)

2．1．1 乙醇濃度對提取率的影響

稱取2.50 g薇菜樣品，按照1∶20的料液比分別加入濃度為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，于65℃恒溫水浴中浸提1.5 h，過濾，離心，測定其黃酮的含量，結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇濃度對提取率的影響

由圖1可以看出，隨著乙醇濃度的升高，得率升高，但當(dāng)乙醇濃度大于80%時(shí)，得率呈下降趨勢，可見乙醇濃度在80%左右時(shí)，提取率最高。

2．1．2 提取時(shí)間對提取率的影響

稱取2.50 g的薇菜樣品，按1∶20的料液比加入濃度為80%的乙醇，在65℃ 恒溫水浴中分別浸提 1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h，過濾，離心，測定其黃酮的含量，結(jié)果見圖2。

圖2 提取時(shí)間對提取率的影響

由圖2可見，隨著時(shí)間的延長，得率升高，但1.5 h以后，得率呈下降趨勢，所以當(dāng)提取1.5 h時(shí)，提取率最高。

2．1．3 料液比對提取率的影響

稱取2.50 g的薇菜樣品，分別加入料液比為1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30 的 80% 的乙醇，于65℃ 恒溫水浴浸提1.5 h，過濾，離心，測定其黃酮的含量，結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對提取率的影響

由圖3可見，隨著溶劑量的增加，提取率逐漸升高，但當(dāng)料液比達(dá)到1∶25左右時(shí)，提取率最高。

2．1．4 提取溫度對提取率的影響

稱取2.50 g的薇菜樣品，按1∶25的料液比加入濃度為80%的乙醇，分別在60℃、65℃、70℃、75℃、80℃的恒溫水浴下浸提1.5 h，過濾，離心，測定其黃酮的含量，結(jié)果見圖4。

圖4 提取溫度對提取率的影響

由圖4可見，黃酮的提取率隨著溫度的升高而升高，但在65℃以上時(shí)，曲線呈下降趨勢，所以在65℃ 時(shí)，提取率最高。

2．2 黃酮提取的正交試驗(yàn)

為確定乙醇提取工藝的最佳條件，設(shè)計(jì)如下正交試驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知:各因素的影響大小為提取時(shí)間＞溫度＞料液比＞乙醇濃度;最佳的提取條件為A2B1C2D2，即提取時(shí)間為1.5 h，提取溫度為65℃，料液比為1∶25，乙醇濃度為80%。

2．3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，總黃酮的平均得率為15.723 mg/g，高于正交實(shí)驗(yàn)方案中的所有組合，說明工藝優(yōu)化成功。

2．4 抗氧化活性分析

根據(jù)公式 AOV=(V0－V1)×M ×34/0.1，式中，V0為空白對照消耗硫代硫酸鈉的體積，V1為樣品溶液消耗硫代硫酸鈉的體積，M為硫代硫酸鈉的摩爾濃度0.05 mol/L，34為過氧化氫的摩爾濃度，0.1為常數(shù)，研究結(jié)果如圖5所示。

圖5 黃酮濃度對抗氧化值的影響

由圖5可以看出，在低濃度時(shí)，黃酮類化合物的抗氧化值隨其濃度的升高而升高，但當(dāng)黃酮類化合物的濃度繼續(xù)升高時(shí)，曲線趨于平緩。這就是說，黃酮類化合物的抗氧化值隨其濃度的升高而升高，且先快后慢。

3 結(jié)論

薇菜中黃酮類化合物提取的最佳工藝條件為:乙醇的濃度為80%，料液比為1∶25，提取時(shí)間為1.5 h，溫度為65℃，在該條件下的得率為15.723 mg/g。

薇菜中黃酮類化合物具有一定的抗氧化性，且隨著添加量的增加，抗氧化作用增強(qiáng)，最后趨于平緩，達(dá)到最大值。

［1］陸柏益，張英，吳曉琴．竹葉黃酮的抗氧化性及其心腦血管藥理活性研究進(jìn)展［J］．林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2005，25(3):120－124．

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［5］張燦，張海暉，武妍．馬蘭黃酮類化合物的提取及其抗氧化活性［J］．農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2011，27(2):307 －311．