水飛薊賓乳糖苷的合成、表征及抗氧化活性研究

汪艷麗，余燕影，曹樹穩(wěn)

南昌大學(xué)化學(xué)系，南昌 330031

水飛薊賓是從水飛薊的果實種皮中提取分離出來的一種黃酮木脂素類化合物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，水飛薊賓具有保肝(抗肝纖維化、保護(hù)肝細(xì)胞膜、促進(jìn)肝細(xì)胞的修復(fù)再生)、抗癌及抗氧化等生物活性［1-3］。由于水飛薊賓存在水溶性較差，作用靶點多等缺陷，使其臨床應(yīng)用受到一定的限制。因此對水飛薊賓進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，對提高其水溶性、生物利用度，增強(qiáng)其生物活性具有重要的意義。

有關(guān)水飛薊賓化學(xué)修飾改善其水溶性主要有酯化、糖苷化和成鹽等途徑［4］，本實驗室前期對水飛薊賓進(jìn)行了酯化修飾，有效提高了水飛薊賓的水溶性和抗氧化活性。糖基修飾可使母體活性先導(dǎo)化合物作用靶點專一化，可與前體藥物發(fā)揮協(xié)同作用，有效提高藥效、降低其毒副作用［5］，乳糖不僅水溶性好，且有與肝實質(zhì)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面受體定向結(jié)合的特性［6］。本文擬將水飛薊賓進(jìn)行乳糖修飾，以期提高其水溶性和生物活性，為水飛薊賓臨床用藥提供理論依據(jù)。合成路線見圖1

圖1 水飛薊賓乳糖苷的合成路線Fig.1 Synthetic routes of silybin lactosified derivatives

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

FTIR Nicolet5700傅里葉變換紅外光譜儀(美國熱電尼高力公司);AV-600型核磁共振儀(德國BRUKER公司);X-4顯微熔點測定儀(河南豫華儀器有限公司)(溫度計未校正);DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);DZF-150數(shù)顯小型恒溫真空干燥箱(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);日立高效液相色譜儀(L-2500)(日立有限公司);ZQ24000/2695四極桿LC/MS聯(lián)用儀(美國Waters公司)

水飛薊賓(簡稱Sil，95%，遼寧盤錦格林恩生物資源開發(fā)有限公司);硅膠(200～300目，青島海浪硅膠干燥劑廠);水溶性維生素E(Trolox，Sigma公司)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純，所用水均為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 全乙酰乳糖(1，2，3，6，2'，3'，4'，6'-8-O-乙酰基-(-吡喃乳糖)的合成

制備全乙酰乳糖，收率90.19%。mp.136～138 ℃。IR(KBr)，ν/cm-1:3433，1752，1620，1375，1217，1133，1046，901，605，548。1H NMR(DMSO-d6，600 MHz):5.88(d，1H，J=8.4 Hz)，5.34(t，1H，J=9.0 Hz)，5.23(dd，1H，J=3.6 Hz，J=1.2 Hz)，5.16(dd，1H，J=10.2 Hz，J=3.6 Hz)，4.86(m，2H)，4.77(d，1H，J=7.8 Hz)，4.28(d，1H，J=10.2 Hz)，4.23(t，1H，J=6.6 Hz)，4.03(m，4H)，3.85(t，1H，J=9.0 Hz)，2.10(s，3H，-OCCH3)，2.06(s，3H，-OCCH3)，2.04(s，3H，-OCCH3)，2.00(s，3H，-OCCH3)，1.99(s，3H，-OCCH3)，1.98(d，J=1.2 Hz，6H，2 × -OCCH3)，1.89(s，3H，-OCCH3)。

1.2.2 水飛薊賓乙酰乳糖苷(簡稱Sil-LacAcO8)的合成

將3.8600 g(8 mmol)水飛薊賓和8.1096 g(12 mmol)全乙酰乳糖溶于448 mL CH2Cl2-CH3CN(1∶1，v/v)?；旌先軇┲?，于25℃在氮氣保護(hù)下攪拌，快速加入14 mL(152.5 mmol)BF3·Et2O，反應(yīng)20 h后傾入冰NaHCO3飽和溶液中，用CH2Cl2萃取(150 mL×2)，有機(jī)相用Na2SO4干燥，過濾除去固體，旋干溶劑。將粗產(chǎn)物與硅膠(200～300目)按1∶1.5拌樣，硅膠柱層析，先用氯仿-甲醇(25∶2)混合溶劑進(jìn)行淋洗除去未反應(yīng)完的原料和雜質(zhì)，再用甲苯-丙酮(20∶1)溶劑洗脫，收集最后組分洗脫液、濃縮、55℃真空干燥后得到白色粉末狀目標(biāo)產(chǎn)物I。產(chǎn)率為40.65%，經(jīng)高效液相色譜歸一法檢測純度為96.65%。

1.2.3 水飛薊賓乳糖苷(簡稱Sil-Lac)的合成

將合成的目標(biāo)產(chǎn)物I置于Et3N-MeOH-H2O(1∶8∶1)溶劑中，在35℃下反應(yīng)24 h脫乙酰保護(hù)基。反應(yīng)液減壓濃縮后上硅膠(200～300目)柱層析，用乙酸乙酯-甲醇-水(10∶1∶0.6)溶劑洗脫，收集洗脫液，濃縮，真空干燥后得到淡黃色粉末狀目標(biāo)產(chǎn)物II。熔點為204 ～206℃，產(chǎn)率為23.65%，經(jīng)高效液相色譜歸一法檢測純度為95.42%。

1.2.4 清除DPPH自由基實驗

參照文獻(xiàn)［7］的方法，反應(yīng)體系略作修改。取不同濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L)的待測樣品甲醇溶液各0.5 mL于10 mL的比色管中，加入0.5 mL DPPH(0.6 mmol/L)甲醇溶液，用甲醇定容至5 mL，室溫下避光放置30 min，于517 nm處測定混合物的吸光度，每組樣品平行三次。

式中:A0為DPPH緩沖液的吸光值，A1為加入受試樣品和DPPH混合液的吸光度。

1.2.5 還原能力測定

參照Singh等［8］的方法，反應(yīng)體系略作修改。取不同濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)的水飛薊賓及水飛薊賓乳糖修飾物溶液各2.5 mL于10 mL的比色管中，依次加入2.5 mL的磷酸緩沖液(0.2 mol/L、pH 6.6)和2.5 mL的鐵氰化鉀(1%)?；靹蚝?，于50℃的水浴中保溫反應(yīng)20 min，準(zhǔn)確取2.5 mL的上清液，加入2.0 mL蒸餾水以及0.5 mL的氯化鐵溶液(0.1%)，混合均勻后測定混合物在700 nm處的吸光度，吸光度值越大表明還原能力越強(qiáng)，每組樣品進(jìn)行三次平行實驗。

1.2.6 ABTS+自由基清除能力的測定

參照文獻(xiàn) Re、R［9］的方法，反應(yīng)體系略作修改。ABTS+儲備液的配置:將7 mmol/L的ABTS水溶液與2.45 mmol/L的K2S2O8溶液混合，室溫暗處放置12～16 h后方能使用。ABTS+工作液:使用前將ABTS+儲備液用甲醇稀釋，于734 nm處測定其吸光度值為0.70 ±0.02后便能使用。取不同濃度(0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mmol/L)的水飛薊賓及其乳糖苷修飾物0.5 mL及ABTS+工作液5 mL，空白對照為甲醇，室溫避光反應(yīng)6 min后，于734 nm處測定吸光值。平行測定三次，結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

其中A1為ABTS+加入甲醇混合液的吸光值，A2為ABTS+加入不同濃度受試樣品混合液的吸光度。

1.2.7 大鼠肝微粒體脂質(zhì)過氧化的測定

肝微粒體的制備［10］:Wistar大鼠，體重230 ～270 g，饑餓24 h左右，斷頸處死，馬上取出肝臟，用冷0.25 mol/L蔗糖(0.01 mol/L)Tris(pH 7.4)緩沖液沖洗，迅速放入冰水中，并用玻璃勻漿器研磨。4℃，10000 g，離心10 min，取上清于 4 ℃，100000 g，離心20 min，得到沉淀物即為大鼠肝微粒體。用磷酸鉀緩沖液將微粒體重懸起即進(jìn)行測試，或于-20℃保存。微粒體蛋白濃度用考馬斯亮藍(lán)法測定。

參照文獻(xiàn)［11］報道方法，反應(yīng)體系略作修改:分別配制濃度為 31.125、62.25、125、250、500 μmol/L的水飛薊賓，水飛薊賓-23乙酰乳糖苷，水飛薊賓-23-乳糖苷和Trolox溶液。將1.0 mL線粒體懸液(蛋白含量在0.4 ～0.7 mg/mL)，0.5 mL樣品溶液，0.25 mL Fe2+溶液和0.25 mL維生素C依次加入10 mL比色管中，于37℃水浴中振蕩孵育1 h后，加入20%TCA，隨后加入2 mL 0.67%TBA，95℃的水浴，顯色30 min后，3500 r/min離心10 min，取上清液，532 nm處測定其吸光值，每組實驗平行三次。

式中A0為陽性組的吸光值，A1為受試樣品組的吸光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 水飛薊賓乙酰乳糖苷的譜學(xué)數(shù)據(jù)

MS m/z:1099 ［M-H］-，IR(KBr)，ν/cm-1:3467(OH)，2943(CH3)，1752(C=O)，1641(C=O)，1513(Ar-H)，1435(Ar-H)，1372(CH3)，1231(CO-C)，1165，1050(C-O-C)，905，828，736，601;1H NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ:11.88(d，1H，J=3.0 Hz，5-OH)，10.86(s，1H，7-OH)，9.16(s，1H，20-OH)，7.09(d，1H，J=1.8 Hz，13-H)，7.01(dd，1H，J=8.4 Hz，J=2.4 Hz，15-H)，7.00(d，1H，J=1.8 Hz，18-H)，7.17(d，1H，J=8.4 Hz，16-H)，6.97(d，1H，J=8.4 Hz，22-H)，6.81(d，1H，J=8.4 Hz，21-H)，5.92(d，1H，J=1.8 Hz，6-H)，5.86(d，1H，J=2.4 Hz，8-H)，5.79(s，1H，3-OH)，5.09(d，1H，J=11.4 Hz，2-H)，4.91(d，1H，J=8.4 Hz，11-H)，4.61(m，1H，3-H)，3.99(m，1H，23-Ha)，3.77(m，1H，23-Hb)，3.79(s，3H，19-OMe)，(糖環(huán)上氫信號)5.26(t，1H，J=9.2 Hz，4'-H)，5.22(d，1H，J=2.4 Hz，4''-H')，5.16(dd，1H，J=10.2 Hz，J=3.6 Hz，2'-H)，5.14(dd，1H，J=7.2 Hz，J=3.6 Hz，2''-H)，4.29(d，1H，J=10.8 Hz，1'-H)，4.23(t，1H，J=6.6 Hz，1''-H)，4.17(m，2H，6'-Hb，6''-Hb)，4.02(m，2H，6'-Ha，6''-Ha)，3.75(t，1H，J=9.0 Hz，5'-H)，5.87(d，J=2.4 Hz，1H)，4.84(m，2H)，4.75(d，1H，J=7.8 Hz)，(乙酰乳糖苷上七個乙?；?2.10(s，3H)，2.07(s，3H)，2.00(s，3H)，1.99(s，3H)，1.96(s，3H)，1.91(s，3H)，1.90(s，3H).

2.2 水飛薊賓乳糖苷譜學(xué)數(shù)據(jù):

1H NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ:11.89(d，1H，J=1.8 Hz，5-OH)，10.86(s，1H，7-OH)，9.16(s，1H，20-OH)，7.09(d，1H，J=1.8 Hz，13-H)，7.08(d，1H，J=1.8 Hz，13-H)，7.01(dd，1H，J=8.4 Hz，J=2.4 Hz，5-H)，7.00(d，1H，J=1.8Hz，8-H)，6.98(d，1H，J=8.4 Hz，16-H)，6.97(d，1H，J=8.4 Hz，16-H)，6.87(d，1H，J=8.4 Hz，22-H)，6.81(d，1H，J=8.4 Hz，21-H)，5.92(d，1H，J=2.4 Hz，6-H)，5.87(m，1H，8-H)，5.81(s，1H，3-OH)，5.09(d，1H，J=11.4 Hz，2-H)，4.91(d，1H，J=8.4 Hz，11-H)，4.61(m，1H，3-H)，4.28(m，1H，23-Ha)，3.78(m，1H，23-Hb)，3.79(s，3H，19-OMe)，(糖環(huán)上信號)4.95(m，2H)，4.09-4.18(m，2H)，53-3.74(m，3H)，3.17(d，2H).

13C NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ:56.14(s，19-OMe)，60.63(s，C-23)，71.91(d，C-3)，78.98(s，C-10)，78.58 d and 78.56 d(C-11)，82.98(s，C-2)，96.51(s，C-6)，98.73(s，C-1')100.92(s，C-4a)，103.56(s ，C-1'')，112.15 s and 112.08 s(C-18)，116.99 d and 116.80 d(C-13)，116.75 d and 116.67 d(C-21)，117.31 d and 117.10 d(C-16)，121.04 d and 120.97 d(C-22)，121.82 d and 121.73 d(C-15)，127.93 s and 127.69 s(C-17)，130.54 s and 130.50 s(C-14)，144.11 s and 144.08 s(C-12a)，145.50(s，C-16a)，147.54 s and 147.46(C-20)，148.12s and 184.08 s C-19，163.75(s，C-8a)，164.51(s，C-5)，167.26(s，C-7)，198.24(s，C-4)，76.35，76.31，71.84，60.55。

2.3 樣品的水溶性測定

參照文獻(xiàn)［12］方法，測得 Sil的溶解度為18.9 mg/L，Sil-LacAcO8的溶解度為 20.1 mg/L，Sil-Lac的溶解度為280.80 mg/L，結(jié)果表明水飛薊賓經(jīng)糖苷化后，水溶性提高了14.8倍。

2.4 清除DPPH實驗

圖2 受試物清除DPPH活性Fig.2 DPPH scavenging activity of tested compounds

由圖2可知，受試樣品均具有清除DPPH自由基的能力，且呈現(xiàn)濃度依賴性，在所測試的濃度范圍內(nèi)，水飛薊賓乳糖苷能顯著的提高清除DPPH自由基的能力，這可能與引入乳糖基提供了更多的羥基而增強(qiáng)了其提供氫原子的能力有關(guān)。當(dāng)濃度達(dá)到50 μM時，其清除率可達(dá)71.30%。結(jié)果表明，乳糖苷清除 DPPH自由基的能力有了明顯提高，與Trolox的清除DPPH的能力不相上下。

2.5 還原能力實驗

圖3 待測物的還原能力Fig.3 Reducing power of tested compounds

由圖3可知，受試物均具有還原Fe3+的能力，具有濃度依賴性。在受試濃度范圍內(nèi)，水飛薊賓乳糖苷的還原能力較水飛薊賓和水飛薊賓乙酰乳糖苷有顯著提高。當(dāng)濃度達(dá)到125 μM時，其吸光值已達(dá)到1.624，約是水飛薊賓0.267的6倍，這可能是水飛薊賓乳糖苷引入了乳糖基含有多個羥基，顯著提高了其供電子能力，從而增強(qiáng)了其還原能力。結(jié)果表明，乳糖苷的還原能力有了顯著提高，而略低于Trolox。

2.6 清除ABTS+實驗

圖4 受試物清除ABTS+自由基的能力Fig.4 ABTS+radicals scavenging activity of tested compounds

由圖4可知，受試物清除ABTS+自由基的能力表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系，隨著濃度的不斷增大，其清除ABTS+自由基的能力逐漸增強(qiáng)。水飛薊賓乳糖苷具有最好的效果，當(dāng)濃度達(dá)到9.10 μM時，水飛薊賓乳糖苷清除ABTS+自由基的能力趨于穩(wěn)定，達(dá)到90%以上，而水飛薊賓和水飛薊賓乙酰乳糖苷在此濃度下其清除率為30% ～50%左右，最終水飛薊賓乳糖苷趨于100%。結(jié)果表明，經(jīng)乳糖修飾后，水飛薊賓清除ABTS+自由基的能力有了明顯提高，比陽性對照物Trolox效果好。

2.7 抑制大鼠肝微粒體脂質(zhì)過氧化能力的測定

圖5 受試物的抗脂質(zhì)過氧化活性Fig.5 Inhibition of lipid peroxidantion by tested compounds

Fe2+/VC體系在溶液中產(chǎn)生的OH·和過氧化物引發(fā)后產(chǎn)生ROO·，能導(dǎo)致微粒體細(xì)胞膜和細(xì)胞蛋白質(zhì)的脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)而產(chǎn)生多種醛類物質(zhì)，對生物體極具損傷作用，其中丙二醛(MDA)是主要的終產(chǎn)物，因此，MDA反映出機(jī)體細(xì)胞脂質(zhì)過氧的程度，也間接反應(yīng)出線粒體細(xì)胞膜受破壞的程度［11］。MDA與TBA共熱產(chǎn)生的粉紅色物質(zhì)在532 nm處有吸收峰，由此可知，受試物的吸光度隨MDA的含量變化而變化，吸光度越小，表示其抗氧化能力越強(qiáng)。由圖5可知，受試物均具有較好的抑制大鼠肝微粒體脂質(zhì)過氧化活性，且具有濃度依耐性，量效關(guān)系較好。在最低濃度5.19 μM時，水飛薊賓乳糖苷就體現(xiàn)出較好的抑制脂質(zhì)過氧化活性;當(dāng)濃度在10.38～41.50 μM時。受試物的抑制脂質(zhì)過氧化活性明顯的提高，且在41.50 μM后趨于穩(wěn)定，水飛薊賓乳糖苷的活性最強(qiáng);當(dāng)達(dá)到最大濃度83.00 μM時，受試物的對脂質(zhì)過氧化的抑制率均超過80%，且水飛薊賓乳糖苷達(dá)到100%。結(jié)果表明，將水飛薊賓修飾成乳糖苷后，其抗脂質(zhì)過氧化能力得到明顯提高，且明顯好于trolox。這可能與引入乳糖基后提高了水飛薊賓清除自由基能力，有效地阻止脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)，從而達(dá)到增強(qiáng)其抗脂質(zhì)過氧化活性。

3 結(jié)論

以天然活性物質(zhì)作為先導(dǎo)化合物，對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和改造，是新藥開發(fā)的有效途徑之一。水飛薊賓經(jīng)乳糖修飾后水溶性有了較大提高，抗氧化實驗表明，水飛薊賓乳糖苷較水飛薊賓還原Fe3+能力，清除DPPH自由基能力，清除ABTS+自由基能力和抗脂質(zhì)過氧化能力均得到不同程度的提高。不同的抗氧化模型雖然機(jī)理不同，但實驗結(jié)果基本一致，均有較好的濃度依賴性。因此，水飛薊賓乳糖苷有望作為天然高效的抗氧化劑應(yīng)用于醫(yī)藥、食品以及化妝品等領(lǐng)域。

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