糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)cAMP、cGMP、Na+-K+-ATP的變化及益氣活血通絡(luò)方的干預(yù)作用

李 光 張文風(fēng) 于 海 馬金鈴 (長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117)

環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)廣泛存在于動(dòng)物機(jī)體各種組織中，cAMP不僅充當(dāng)?shù)诙攀菇巧?〕，還具有多種調(diào)節(jié)功能。神經(jīng)組織中cAMP、cGMP含量下降的同時(shí)Na+-K+-ATP酶活性也相應(yīng)降低，神經(jīng)的動(dòng)作電位異常，傳導(dǎo)速度減慢。以往研究表明，益氣活血通絡(luò)方可以降低糖尿病(DM)大鼠血糖、提高其體重、坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度、改善血清胰島素、C肽以及抑制細(xì)胞凋亡等作用〔2～8〕。在前期研究基礎(chǔ)上，本文以大鼠坐骨神經(jīng)cAMP、cGMP含量、Na+-K+-ATP活性的變化為觀察指標(biāo)，探究其對(duì)神經(jīng)軸突的再生和修復(fù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 模型的建立 選用雄性健康Wistar大鼠，體重(240±20)g。適應(yīng)性飼喂1 w后，禁食12 h，將鏈脲佐菌素臨用配成2%濃度溶液，按劑量50 mg/kg左下腹腔內(nèi)單次注射，72 h后取尾血測(cè)血糖，血糖≥16.7 mmol/L作為DM大鼠。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后將成模大鼠隨機(jī)分為3組，即模型組、中藥組、彌可保組，每組10只。并取體重、鼠齡相匹配的同批血糖值在正常范圍內(nèi)正常大鼠10只作為正常對(duì)照組。連續(xù)觀察8 w后處死。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 AnkeTDL-5-A型離心機(jī)(上海醫(yī)療器械有限公司)，GC-911-r-放射免疫計(jì)數(shù)器(中國科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司)，7225型分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)。

1.3 藥品及試劑 益氣活血通絡(luò)方組成藥物(黃芪、桂枝、生地、水蛭)均購于長(zhǎng)春市同仁堂藥房，長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)王淑敏教授鑒定，煎制成2 g/ml，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩AMP、cGMP放射免疫分析藥盒(北京北方生物技術(shù)研究所，批號(hào)121020、121026)。Na+-K+-ATP酶測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào):20121026)。

1.4 體重、血糖檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，稱其體重。取尾靜脈血檢測(cè)血糖。

1.5 大鼠坐骨神經(jīng)cAMP、cGMP檢測(cè) 大鼠在麻醉狀態(tài)下，切開雙側(cè)股后部皮膚，分離出雙側(cè)坐骨神經(jīng)。剪下后快速放入干冰中保存。在冰浴環(huán)境下，將坐骨神經(jīng)放入盛有2 ml冷的0.05 mol/L醋酸緩沖液(pH4.75)的勻漿器內(nèi)，將組織粉碎后，懸浮液倒入10 ml試管內(nèi)，用2 ml無水乙醇洗勻漿器，然后將乙醇倒入懸浮液中混勻，靜止5 min，3 500 r/min離心15 min，將上清液收集在小瓶?jī)?nèi)，用2 ml 75%乙醇洗勻漿器和沉淀2次，混勻，3 500 r/min離心15 min，合并上清液，60℃水浴中吹干，殘?jiān)庞?℃保存。嚴(yán)格按照試劑測(cè)定盒的要求檢測(cè)。

1.6 大鼠坐骨神經(jīng)Na+-K+-ATP檢測(cè) 取兩側(cè)坐骨神經(jīng)，生理鹽水洗凈后剪碎，加冷生理鹽水制成10%坐骨神經(jīng)組織勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。嚴(yán)格按照試劑測(cè)定盒的要求檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 選用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，各組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重、血糖變化 與正常組比較，模型組、中藥組、彌可保組體重明顯降低，血糖明顯升高，差異顯著(P＜0.05);與模型組相比，中藥組動(dòng)物的體重明顯升高，血糖明顯降低，差異顯著(P＜0.05);中藥組與彌可保組相比，體重明顯升高，血糖明顯降低，差異顯著(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體重、血糖變化的比較(±s)

表1 各組大鼠體重、血糖變化的比較(±s)

與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05;與彌可保組比較:3)P＜0.05

組別 n 體重(kg) 血糖(mmol/L)正常組10 316.8±23.9 4.5 ±0.8模型組 7 197.2±20.51) 21.6±2.71)彌可保組 8 208.5±23.21) 20.1±3.21)中藥組 9 246.4±26.51)2)3) 15.1±2.61)2)3)

2.2 各組大鼠坐骨神經(jīng)cAMP、cGMP、Na+-K+-ATP酶變化與正常組比較，模型組、中藥組、彌可保組cAMP、cGMP含量、Na+-K+-ATP酶活性明顯降低，差異顯著(P＜0.05);與模型組相比，中藥組動(dòng)物的cAMP、cGMP含量明顯升高，Na+-K+-ATP酶活性明顯提高，差異顯著(P＜0.05);中藥組與彌可保組相比無顯著差異(P＞0.05)。見表2。

表2 各組大鼠cAMP、cGMP、Na+-K+-ATP變化的比較(±s)

表2 各組大鼠cAMP、cGMP、Na+-K+-ATP變化的比較(±s)

與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

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3 討論

DM周圍神經(jīng)病變是DM的重要并發(fā)癥之一，屬于中醫(yī)的痹證、痿證范疇。中醫(yī)認(rèn)為，DPN是由于DM日久，氣陰兩虛、瘀血阻絡(luò)所致。益氣活血通絡(luò)法方由黃芪、桂枝、水蛭、生地組成，具有養(yǎng)陰益氣、活血化瘀之功。

cAMP、cGMP廣泛存在于動(dòng)物機(jī)體的各種組織中。cAMP具有各種調(diào)節(jié)功能，神經(jīng)組織中cAMP、cGMP含量下降的同時(shí)，Na+-K+-ATP酶的活性也降低，將影響神經(jīng)的正常動(dòng)作電位，使神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢。cGMP信號(hào)的產(chǎn)生，是鳥苷酸環(huán)化酶(GC)催化的，其中的一類胞內(nèi)可溶性環(huán)化酶與NO的傳導(dǎo)有關(guān)，NO有使血管舒張的作用〔9〕。

綜上，益氣活血通絡(luò)方能提高坐骨神經(jīng)組織中 cAMP、cGMP含量、提高Na+-K+-ATP酶的活性，可能是其促進(jìn)神經(jīng)軸突的再生和修復(fù)作用及機(jī)制之一。

1 朱禧星.現(xiàn)代糖尿病〔M〕.上海:上海醫(yī)科大學(xué)出版社，2000:333.

2 張文風(fēng).益氣活血通絡(luò)方對(duì)糖尿病大鼠血清胰島素、C肽的影響〔J〕.湖南中醫(yī)雜志，2008;24(5):98-9.

3 張文風(fēng).益氣活血通絡(luò)方防治糖尿病周圍神經(jīng)病變的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中醫(yī)藥信息，2008;25(6):24-5.

4 張文風(fēng)，蘇 鑫，粟 栗.糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)AGEs的表達(dá)及益氣活血通絡(luò)方的干預(yù)研究〔J〕.上海中醫(yī)藥雜志，2010;3:25-6.

5 張文風(fēng)，樸今哲，蘇 鑫，等.從血液流變學(xué)和神經(jīng)傳導(dǎo)速度評(píng)價(jià)益氣活血通絡(luò)方對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變的干預(yù)作用〔J〕.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010;2:686-8.

6 李鐵成，張文風(fēng).糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度與其超微結(jié)構(gòu)的相關(guān)性及益氣活血通絡(luò)中藥的干預(yù)研究〔J〕.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010;7:1657-9.

7 張文風(fēng)，鐘慧群，汪 勤.糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞凋亡及其調(diào)控基因的表達(dá)及益氣活血通絡(luò)方的干預(yù)研究〔J〕.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011;4:1121-3.

8 鐘慧群，張文風(fēng)，蘇 鑫，等.糖尿病大鼠糖化血清蛋白與AGES的相關(guān)性及中藥的干預(yù)作用〔J〕.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011;6:1453-5.

9 孫大業(yè).細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)〔M〕.第3版.北京:科技出版社，2003:124.