EPCAM在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

潘群雄 蘇子劍 王聰仁 莊建良 (福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院腫瘤外科，福建 泉州 362000)

食管鱗狀細(xì)胞癌是我國(guó)常見惡性腫瘤之一，盡管近年來在診斷和治療方面均取得了巨大的進(jìn)步，但其總體療效仍不理想，且對(duì)于食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展過程及相關(guān)分子機(jī)制尚不清楚。食管鱗狀細(xì)胞癌可能是一種干細(xì)胞性疾病。因此腫瘤干細(xì)胞學(xué)說的提出，為食管鱗狀細(xì)胞癌的研究帶來了新的希望。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志EPCAM在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)，探討可能影響食管鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后的因素，以及EPCAM在食管鱗狀細(xì)胞癌癌發(fā)生、發(fā)展中可能的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 病例資料 選取我院1995～2004年間行食管癌根治術(shù)且隨訪資料完整的90例病例，術(shù)前均未進(jìn)行放、化療及免疫治療，且術(shù)后根據(jù)指南進(jìn)行相應(yīng)輔助治療。其生存期從手術(shù)之日起開始計(jì)算，終止日期為死亡期或末次隨訪日期，截止日期為2011年1月30日。隨訪期限從24～84個(gè)月不等，平均隨訪日期為52.73個(gè)月。所有患者的手術(shù)標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，分別做HE染色及免疫組化染色。

食管鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)前均未行放療或化療，均經(jīng)術(shù)后病理組織學(xué)確診，均有完整的臨床病理資料，年齡32～75〔平均 (45±8.5)〕歲，＜60歲65例，≥60歲25例;其中男65例，女25例;高分化20例，中分化52例，低分化18例;TNM分期:Ⅰ+Ⅱ期63例，ⅢA期27例;脈管有瘤栓13例，脈管無瘤栓77例;浸潤(rùn)至黏膜下層或肌層63例，浸潤(rùn)至食管纖維膜27例;淋巴結(jié)有癌轉(zhuǎn)移28例，淋巴結(jié)無癌轉(zhuǎn)移62例。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 鼠抗人EPCAM單克隆抗體購(gòu)于antibodiesonline。Elivision試劑盒，胃蛋白酶，H2O2，內(nèi)源性生物素阻斷試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)過程 采用免疫組化Elivision法染色，嚴(yán)格按試劑盒說明方法操作。石蠟切片脫蠟水化，EPCAM采用EDTA抗原修復(fù)液，微波加熱使之維持92℃ ～95℃15 min，室溫放置20 min后自然冷切后取出玻片。3%H2O2孵育，生物素阻斷劑阻斷。加入一抗 CD133、EPCAM單克隆抗體，工作濃度為1∶100，二抗孵育，DAB顯色，脫水，透明，封片。用已知的陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 兩位病理醫(yī)師獨(dú)立觀察，隨機(jī)采集10個(gè)有代表性的視野計(jì)數(shù)，取平均值。CD24陽(yáng)性染色判斷標(biāo)準(zhǔn):胞質(zhì)或胞膜有棕黃色顆粒沉著者為陽(yáng)性染色。依陽(yáng)性細(xì)胞百分率判定陽(yáng)性強(qiáng)度。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性，10%為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用SPSS17.0軟件，EPCAM蛋白表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌臨床病理病理學(xué)特征采用χ2檢驗(yàn);生存分析采用Kaplan-Meier法分析，不同生存曲線的差異性檢驗(yàn)用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn);運(yùn)用多因素COX模型法來綜合評(píng)價(jià)和權(quán)衡各因素對(duì)預(yù)后生存的影響。

2 結(jié)果

2.1 EPCAM在食管鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁組織中的表達(dá)免疫組織化學(xué)染色顯示癌旁組織EPCAM少數(shù)呈弱陽(yáng)性表達(dá)，食管鱗狀細(xì)胞癌組織CD24明顯表達(dá)，陽(yáng)性定位于細(xì)胞膜上，部分細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)亦染色(圖1)，其他位置未見染色。癌組織與癌旁組織CD24陽(yáng)性表達(dá)差異具有顯著性(67.78%vs 21.11%，χ2=11.378，P=0.000)。

圖1 EPCAM在不同組織中的表達(dá)(DAB)

2.2 EPCAM與食管鱗狀細(xì)胞癌病理參數(shù)的關(guān)系 食管鱗狀細(xì)胞癌組織EPCAM表達(dá)與患者的年齡、性別、病理分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。浸潤(rùn)程度較深的癌組織中CD24表達(dá)水平明顯高于對(duì)應(yīng)組(P＜0.05)，見表1。

表1 EPCAM陽(yáng)性表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌病理參數(shù)的關(guān)系(n)

2.3 食管鱗狀細(xì)胞癌組織中EPCAM蛋白陽(yáng)性表達(dá)與患者生存時(shí)間的關(guān)系 表2示EPCAM表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性食管鱗狀細(xì)胞癌患者生存率明顯低于EPCAM表達(dá)強(qiáng)度較低組(χ2=18.730，P=0.000)。

表2 EPCAM表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌總生存率的關(guān)系

2.4 COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析 對(duì)可能影響食管鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后的8個(gè)相關(guān)因素:EPCAM、患者的年齡、性別、組織學(xué)分級(jí)、浸潤(rùn)深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，有無脈管浸潤(rùn)，TNM分期，進(jìn)行多因素COX模型分析，結(jié)果顯示，有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度和EPCAM是影響肝癌預(yù)后的因素(P＜0.05，表3)。

表3 食管鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理特征多因素Cox回歸分析結(jié)果

3 討論

復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是影響食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的根本原因。腫瘤干細(xì)胞學(xué)說認(rèn)為腫瘤組織中存在極少量腫瘤細(xì)胞，在腫瘤發(fā)展中充當(dāng)干細(xì)胞角色，具有自我更新和無限分化、增殖潛能，在啟動(dòng)腫瘤形成和生長(zhǎng)中起著關(guān)鍵性作用，決定腫瘤的形成、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移;而其余大多數(shù)腫瘤細(xì)胞經(jīng)過短暫的分化后最終死亡。人類腫瘤干細(xì)胞首次報(bào)道給我們帶來了希望〔1〕。

EPCAM表達(dá)于人類部分正常上皮細(xì)胞和大多數(shù)惡性上皮腫瘤細(xì)胞表面。Went等〔2〕用免疫組化法研究了3 347份組織標(biāo)本，常見腫瘤EPCAM的表達(dá)情況:食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌均達(dá)到或接近100%;乳腺癌73%，腎癌51.8%，肝細(xì)胞癌14.9%，皮膚鱗癌4.7%，肉瘤4.8%;黑色素瘤、神經(jīng)鞘瘤、淋巴瘤等無表達(dá)。Du等〔3〕用免疫組織化學(xué)染色方法研究發(fā)現(xiàn)，EpCAM在轉(zhuǎn)移性胃癌較非轉(zhuǎn)移性胃癌明顯高表達(dá)。Osta等〔4〕用定量RT-PCR檢測(cè)乳腺正常組織和癌組織EpCAM-mRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)癌組織表達(dá)量是正常組織的100～1 000倍。與正常組織相比，62.5%的舌鱗狀細(xì)胞癌明顯過表達(dá)EPCAM，過表達(dá)EPCAM與腫瘤大小、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高度正相關(guān)〔5〕。EPCAM基因中具有rs1126497 CT表型的喉癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲能力，并與復(fù)發(fā)與進(jìn)展?fàn)顟B(tài)相關(guān)。在原始視網(wǎng)膜母細(xì)胞上觀察到 EPCAM、CD24、ABCG2共表達(dá)〔6〕。實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了EPCAM促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)通過小分子干擾RNA(siRNA)下調(diào)EPCAM的表達(dá)，在體外可明顯抑制胃癌、喉癌、舌鱗狀細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞的黏附、浸潤(rùn)和遷移，在體內(nèi)可抑制胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力用〔3～5〕。在體外實(shí)驗(yàn)中，與EPCAM陰性細(xì)胞相比，EPCAM陽(yáng)性的細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力和神經(jīng)球形成能力〔6〕。通過T細(xì)胞介導(dǎo)的EPCAM×CD3抗體能明顯使原始視網(wǎng)膜母細(xì)胞增殖能力減弱，并使IFN-γ、IL-10、IL-2、TGF-β 等效應(yīng)性細(xì)胞因子分泌減少〔6〕。

Sano等〔7〕對(duì)151例食管鱗狀細(xì)胞癌分析發(fā)現(xiàn)40.4%的食管鱗狀細(xì)胞癌表達(dá)CD24，CD表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期、轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)數(shù)目、淋巴管和脈管浸潤(rùn)正相關(guān)，CD24表達(dá)與無病生存期相關(guān)，多因素分析表明CD24是獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，與本文結(jié)果一致。

EPCAM介導(dǎo)細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)的同質(zhì)黏附，具有加快細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、遷移以及免疫逃逸等多種生物學(xué)功能。Litvinov等〔8〕將EPCAM cDNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞間無黏附功能的鼠成纖維細(xì)胞L細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了變化，細(xì)胞獲得黏附功能并集成細(xì)胞串。EPCAM的黏附作用較E-鈣黏蛋白(E-cadherin)松散，且為鈣離子非依賴性，EPCAM對(duì)E-cadherin介導(dǎo)的黏附有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞分化過程中，EPCAM的黏附作用取代了 E-cadherin保持細(xì)胞正常狀態(tài)，增殖期過后 EPCAM表達(dá)下降，E-cadherin高表達(dá)介導(dǎo)細(xì)胞黏附引發(fā)細(xì)胞的分化。Munz等〔9〕研究顯示，EPCAM過表達(dá)可上調(diào)癌基因C-myc和周期素A、E，加快細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。因而設(shè)想EPCAM表達(dá)的調(diào)節(jié)增強(qiáng)E-鈣黏蛋白等介導(dǎo)的細(xì)胞間黏附，從而影響細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖。最近研究解釋了EPCAM在人腫瘤及腫瘤增殖細(xì)胞高水平表達(dá)與預(yù)后差密切相關(guān)，EPCAM本身有致瘤活性，在于其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域EPICD(含有短的26個(gè)氨基酸)，通過Wnt-β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄的〔10〕。此途徑的一些成分參與EPCAM信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)節(jié)，對(duì)于正常及惡性干細(xì)胞具有顯著意義。

目前EPCAM已用于腫瘤的診斷與治療。Zhang等〔11〕用定量RT-PCR檢測(cè)60例胸、腹腔滲出液脫落細(xì)胞EPCAM-mRNA，發(fā)現(xiàn)其診斷惡性滲液的敏感性、準(zhǔn)確性分別為75.0%和81.6%，均高于細(xì)胞學(xué)檢查的55.6%和67.3%，因而認(rèn)為，Ep-CAM-mRNA是鑒別良惡性滲液的敏感指標(biāo)。在一項(xiàng)開放、多中心的臨床I/Ⅱ臨床實(shí)驗(yàn)中，結(jié)腸癌、胃癌和胰腺癌腹膜轉(zhuǎn)移患者中，應(yīng)用抗EPCAM單抗可抑制腫瘤進(jìn)展〔12〕，給EPCAM陽(yáng)性的上皮源性腫瘤(胃腸道、卵巢、NSCLC等)及惡性腹胸水的免疫導(dǎo)向治療帶來了新的希望。目前，其Ⅱ、Ⅲ期臨床實(shí)驗(yàn)已完成，耐受性良好，副作用少或輕微。

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