力學(xué)刺激對三維培養(yǎng)成年及骨關(guān)節(jié)炎模型兔軟骨細胞產(chǎn)生糖胺多糖的對比

李 鋒 王華軍 聶喜增 關(guān) 鍵 劉金輝 (石家莊市第三醫(yī)院，河北 石家莊 050000)

老年人關(guān)節(jié)軟骨在損傷后缺乏自我修復(fù)能力。組織工程的不斷發(fā)展可為組織的缺損和破壞提供理想的解決辦法，因而軟骨組織工程逐漸成為研究的重點〔1，2〕。聚乳酸支架是軟骨研究中的常用支架材料，具有較好的力學(xué)強度，能傳導(dǎo)應(yīng)力并為細胞提供三維生長環(huán)境〔3，4〕。本研究通過對比分析軟骨細胞在體外三維多孔支架上受到不同循環(huán)壓應(yīng)力時糖胺多糖(GAG)的分泌水平，尋求促進軟骨細胞增殖的壓應(yīng)力強度，為組織工程軟骨的構(gòu)建提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組與骨性關(guān)節(jié)炎(OA)動物模型制備 選取5月齡雄性新西蘭白兔10只，隨機分為成年組及OA組，各5只。將OA組新西蘭白兔麻醉后，雙側(cè)膝關(guān)節(jié)備皮，仰臥固定于實驗臺上，常規(guī)消毒鋪巾，取髕骨旁內(nèi)側(cè)切口，打開關(guān)節(jié)腔，將髕骨外翻脫位，極度屈膝下顯露前交叉韌帶(ACLT)，直視下尖刀切斷，并檢查前抽屜試驗確認手術(shù)效果，注意保護周圍組織。生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔后縫合關(guān)節(jié)腔及皮膚，無菌敷料包扎固定。術(shù)后每只動物給予抗生素預(yù)防感染。正常組實驗動物采用同樣的麻醉方法，打開關(guān)節(jié)腔后，同樣將髕骨脫位，保持關(guān)節(jié)腔暴露時間大致同OA組，但不切OA，其余處理同上。

1.2 大體觀察及Mankin's評分 手術(shù)后20 w使用空氣栓塞法處死動物，在無菌條件下取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)標(biāo)本，去除周圍軟組織，保留關(guān)節(jié)軟骨的部分，取每組動物的左側(cè)膝關(guān)節(jié)大體觀察及Mankin's評分，確認OA動物造模成功。

1.3 軟骨細胞的分離培養(yǎng) 在無菌條件下將兩組動物的膝關(guān)節(jié)游離并用骨剪截取，用生理鹽水充分漂洗，充分刮除關(guān)節(jié)周圍附著的組織如肌肉、脂肪、骨膜、滑膜，后使用D-Hank液充分漂洗。用刀片削取關(guān)節(jié)表面的軟骨，充分漂洗軟骨小塊，用眼科小剪刀剪碎至1 mm3，用小刮匙把軟骨小塊轉(zhuǎn)移至小錐形瓶中。加入適量Ⅱ型膠原酶，37℃消化4 h，吹打1次/h，成混懸液。接種到25 cm的培養(yǎng)瓶，擴增傳代后，選擇二代軟骨細胞，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化收集后，以106個/支架接種到聚乳酸多孔三維支架上，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。同時將成年組與OA組標(biāo)本各自隨機分為加壓組與對照組。

1.4 軟骨細胞周期應(yīng)力的加載 將成年組與OA組的加壓組置于動態(tài)力學(xué)反應(yīng)器中，分別施予壓縮幅度為0% ～5%、0% ～10%、0% ～20%，頻率0.1 Hz，時間6 h/d周期性壓力，連續(xù)作用3 d，對照組不予特殊處理。

1.5 GAG的檢測 采用Alcian blue染色沉淀法測定〔9〕。培養(yǎng)液上清由－20℃取出，置于4℃冰箱中解凍。取標(biāo)準(zhǔn)品和樣本各100 μl加入不同的1.5 ml eppendorf離心管中，分別加入8 mol/L鹽酸胍 50 μl，搖勻后再分別加入 50 μl試劑 1，搖勻靜置10 min，各加入650 μl冰凍試劑2過夜。將過夜的溶液在12 000 r/min的條件下離心15 min，各取700 μl上清液分別移入新1.5 ml離心管，各加入500 μl Alcian blue染液，搖勻后靜置至少1 h，然后再在同樣條件下離心15 min，棄去上清液，分別加入750 μl DMSO洗液，震蕩0.5 h，同樣條件下離心15 min，棄去上清液，再分別加入 500 μl分散液，震蕩15 min后，在600 nm波長下用酶標(biāo)儀測定GAG含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件處理，兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗;計量數(shù)據(jù)以±s表示，兩影響因素間比較用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大體標(biāo)本觀察 成年組的關(guān)節(jié)軟骨色澤正常，表面光滑，未見軟骨表面明顯裂紋及凹陷，無骨贅形成。OA組的關(guān)節(jié)均腫脹變形，表面粗糙糜爛、有裂隙，軟骨面無光澤，色澤灰暗，在滑車及股骨內(nèi)髁出現(xiàn)纖維化，股骨雙髁及脛骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)表面負重區(qū)軟骨有缺損，軟骨下骨外露，骨贅增生明顯，尤以脛骨內(nèi)側(cè)髁明顯，軟骨覆蓋面積小。

2.2 Mankin's評分 成年組的Mankin's評分(2.32±0.87)明顯低于OA組(4.56±1.15)(P＜0.05)。

2.3 GAG含量的檢測結(jié)果成年組與OA組的對照組與加壓組分別在不同壓縮幅度的周期性壓力刺激下GAG的含量見表1。在成年組及OA組的各組中施加壓縮幅度為0%～10%的周期性壓力刺激的一組分泌GAG最高。在成年組及OA組的各組比較，成年組各組的GAG分泌量都高于OA組各組。

表1 各組GAG含量(±s)

表1 各組GAG含量(±s)

組別0 0% ～5% 0% ～10% 0% ～20%成年對照組18.35±1.38 － － －成年加壓組 － 20.22±2.12 26.17±2.25 16.56±2.73 OA對照組 6.56±3.89 － － －OA加壓組 － 9.36±3.78 11.67±3.67 4.61±3.88

3 討論

由于關(guān)節(jié)軟骨無血液供應(yīng)、神經(jīng)支配和淋巴回流，損傷后自身修復(fù)能力非常有限〔5～9〕。軟骨組織工程的興起為軟骨損傷修復(fù)提供了較為理想的新途徑。但是要構(gòu)建功能良好的組織工程化軟骨涉及的因素很多，如種子細胞、支架材料、培養(yǎng)條件等，目前的體外培養(yǎng)組織工程軟骨因與體內(nèi)環(huán)境存在較大差異，很難達到軟骨損傷修復(fù)的臨床要求，因此構(gòu)建接近體內(nèi)環(huán)境的仿生環(huán)境是組織工程研究的熱點。目前研究認為，力學(xué)刺激對關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)代謝及其力學(xué)性能的影響尤為重要。關(guān)節(jié)軟骨由少量的軟骨細胞和大量的細胞外基質(zhì)組成，基質(zhì)的主要成分是蛋白多糖(PG)與膠原蛋白，它是軟骨區(qū)域之間相互聯(lián)系的媒介，是敏感的應(yīng)力傳遞者〔10～15〕。GAG占PG相對分子量90%以上，是其決定性功能基團。許多關(guān)節(jié)退變所導(dǎo)致的骨科疾病均與細胞外基質(zhì)的減少密切相關(guān)。因此，研究力學(xué)刺激對軟骨細胞外基質(zhì)合成的作用特點具有重要意義〔16〕。

適當(dāng)?shù)牧W(xué)刺激可促進軟骨的增殖。但不同強度的壓應(yīng)力對組織工程軟骨的結(jié)構(gòu)與基質(zhì)分泌的影響尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)靜態(tài)壓力對軟骨組織有抑制作用，而其他人的研究發(fā)現(xiàn)使用動態(tài)的壓力刺激軟骨細胞，其可以使軟骨細胞分布更加均勻地改善細胞微結(jié)構(gòu)刺激細胞外基質(zhì)的分泌〔17，18〕。本研究結(jié)果表明周期性壓應(yīng)力對軟骨細胞及其基質(zhì)的增殖分泌具有顯著影響。

目前對于周期性壓力調(diào)節(jié)軟骨細胞的增殖與分泌的機制尚不明確，有研究認為周期性壓力可以促進支架內(nèi)培養(yǎng)液的流動，改善軟骨細胞的營養(yǎng)，促進代謝產(chǎn)物的排出。也有研究認為外源壓應(yīng)力可激活軟骨細胞表面的壓力敏感性離子通道，刺激細胞釋放Ca2+、cAMP等第二信使，促使蛋白磷酸化生長因子分泌增加，從而促進細胞增殖和細胞外基質(zhì)的分泌〔15～18〕。

同時以往的研究結(jié)果顯示不同類型及部位的軟骨細胞在其形態(tài)結(jié)構(gòu)以及功能等多個方面可能具有差異。這也與本研究的結(jié)果一致。其機制尚不明確，可能的原因是由于OA組相應(yīng)細胞器的減少老化，細胞擴增能力減低，以及細胞基質(zhì)內(nèi)各種細胞炎性因子含量的變化。同時還合并有細胞骨架的重排，細胞膜通道及信號傳導(dǎo)、基因表達調(diào)控方式的改變等方面的共同影響。但其明確機制還需進一步研究。

總之，通過比較正常及軟骨細胞的力學(xué)生物學(xué)研究，明確了不同刺激強度的周期性壓力在一定程度上促進了組織工程軟骨細胞的增殖與分泌，尤其可更好地調(diào)節(jié)細胞的新陳代謝，較單純組織培養(yǎng)可構(gòu)建出更佳的支架軟骨，初步認識軟骨細胞在生長成熟和退化過程中的自然規(guī)律及相應(yīng)變化，為骨退行性病變的預(yù)防與治療提供一條新途徑。但其調(diào)控細胞增殖與分泌的詳細機制尚需深入研究。

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