糖尿病性大鼠勃起功能障礙的機(jī)制

王海鵬 姜華茂 (遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院泌尿外科，遼寧 錦州 121000)

陰莖動(dòng)脈血流增加、陰莖海綿體平滑肌舒張以及靜脈回流的減少是陰莖勃起的血流動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)，每個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)功能障礙都能夠引起勃起功能障礙(ED)，而海綿體平滑肌在這個(gè)過(guò)程中扮演著極為重要的角色〔1〕。從海綿體平滑肌的收縮與舒張過(guò)程分析，縫隙連接(GJ)通過(guò)電耦聯(lián)與代謝耦聯(lián)將陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞聯(lián)結(jié)成一個(gè)功能性的整體，與對(duì)于協(xié)調(diào)諸多平滑肌細(xì)胞之間的同步舒張，誘導(dǎo)陰莖海綿體平滑肌松弛與維持勃起有著重要的作用。Cx43作為陰莖海綿體中表達(dá)量最多的縫隙連接蛋白，其與平滑肌細(xì)胞分泌的a-肌動(dòng)蛋白在陰莖勃起及舒張功能中起重要調(diào)控作用〔2〕。男性陰莖ED是糖尿病(DM)的常見并發(fā)癥〔3〕。DM ED的發(fā)病機(jī)制是多因素引起的，高血糖引起的終末器官損害、DM并發(fā)癥及所服用的抗高血壓等藥物的副反應(yīng)都可以導(dǎo)致ED〔4〕。本研究運(yùn)用DMED模型研究血清睪酮水平，陰莖海綿體平滑肌a-肌動(dòng)蛋白(A-actin)及Cx43 CJ蛋白，探討DMED機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 12周齡SD大鼠60只(SPF級(jí))，購(gòu)自遼寧醫(yī)學(xué)院，均為雄性，體重約200～250 g，隨機(jī)均分為兩組，實(shí)驗(yàn)組40只(其中包括DM模型組20只，模型治療組20只)，對(duì)照組20只，交配實(shí)驗(yàn)證實(shí)有正常的勃起功能，自由飲食，12 h/12 h晝夜交替飼養(yǎng)。鏈脲佐菌素(STZ，購(gòu)自Sigma公司)，溶液配制方法為將1.0 g STZ在冰浴中溶解于100 ml的枸櫞酸鈉，枸櫞酸緩沖液(0.1 moL/L，pH4.0)中，配成濃度為10 mg/ml的溶液。阿樸嗎啡(APO，購(gòu)自Sigma公司)，配制方法為APO 4 mg溶解于0.5 mg/kg的維生素C及生理鹽水中，濃度為40 μg/ml。睪酮ELISA試劑盒(購(gòu)自R＆D公司)，血糖儀及配套血糖試紙(購(gòu)自德國(guó)羅氏公司)，兔抗大鼠a-肌動(dòng)蛋白(Actin)、Cx43抗體、羊抗兔二抗(購(gòu)自Abcam公司)。

1.2 模型建立 根據(jù)文獻(xiàn)〔5〕建立DMED模型。DM組禁食8 h后稱重，腹腔內(nèi)按60 mg/kg注射STZ;對(duì)照組給予腹腔注射同劑量枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液。4 d后剪尾取血，每只約0.5 ml，測(cè)空腹血糖，以后每周測(cè)血糖，并觀察大鼠進(jìn)食情況、尿量、體重變化。如出現(xiàn)多飲、多食、多尿、消瘦癥狀，血糖持續(xù)3 w≥16.67 mmol/L為造模成功，血糖標(biāo)準(zhǔn)者未達(dá)到淘汰。造模成功后，DM模型隨機(jī)分為DM模型和DM治療兩組，DM治療組給予皮下注射中性魚精蛋白鋅胰島素(NPH)治療6～8 U/d，血糖控制目標(biāo)為非空腹血糖＜8 mmol/L。DM模型組未行胰島素治療。

1.3 勃起功能的評(píng)價(jià) 飼養(yǎng)12 w后在每只大鼠頸項(xiàng)皮膚松弛處按100 pg/kg注射APO，于注射后立刻觀察30 min，并予以記錄陰莖有無(wú)勃起及勃起次數(shù)，以龜頭充血及末端陰莖體增長(zhǎng)計(jì)陰莖勃起1次。

1.4 睪酮水平的檢測(cè) 脫頸椎處死大鼠后無(wú)菌注射器右心腔采血置于無(wú)菌離心管，25℃靜置 2 h后離心(轉(zhuǎn)速4 000 r/min)，5 min后收集上層血清置于－20℃冰箱備用，待收集所有標(biāo)本后，統(tǒng)一使用ELISA試劑盒完成測(cè)定。

1.5 Western印跡法檢測(cè)平滑肌A-actin及Cx43 CJ蛋白表達(dá)解剖分離出陰莖組織，純水沖洗數(shù)次去除殘余血細(xì)胞及結(jié)締組織，組織研磨，300 μl蛋白提取液(含蛋白酶抑制劑10%)，處理后10 000 r/min離心15 min，提取上清。取2 μl上清液，用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。上樣100 μg SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉20 min，加入兔抗大鼠A-actin抗體(1∶500稀釋)和Cx43抗體(1∶500稀釋)，4℃過(guò)夜，洗膜，加HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)室溫下1 h，ECL顯色，攝X線片。用Quantity one(Rio-Rad)軟件對(duì)X線片上的條帶分析，并以蛋白密度/內(nèi)參的比值對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行定量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0軟件，制圖軟件GraphPad PRISM 5.0。分類變量資料及構(gòu)成比的比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，多組比較應(yīng)用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物一般情況 實(shí)驗(yàn)組40只大鼠注射STZ，達(dá)到DM模型標(biāo)準(zhǔn)(血糖≥16.67 mmol/L)。實(shí)驗(yàn)組36只，隨著病程的進(jìn)展，逐漸出現(xiàn)多飲、多食、多尿、毛失、去光澤、脫毛、活動(dòng)減少、消瘦以及傷口易感染等DM癥狀，5只爛尾，其中DM模型組3只，模型治療組2只，5只大鼠出現(xiàn)白內(nèi)障，其中DM模型組3只，模型治療組2只;死亡4只，其中DM模型組3只，模型治療組1只;而對(duì)照組的大鼠毛色光亮順滑，體重增加，好動(dòng)。

2.2 各組大鼠血糖及注射APO后陰莖勃起的情況 對(duì)照組大鼠血糖波動(dòng)在2.9～5.1 mmol/L，DM模型組血糖波動(dòng)在16.89～27.4 mmol/L，模型治療組血糖波動(dòng)在4.8～6.5 mmol/L，相同周齡大鼠間相比差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。勃起次數(shù)上模型治療組明顯多于模型組(P＜0.01)，仍明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)。勃起率上模型治療組較模型組明顯改善(χ2=5.355，P=0.042)，較對(duì)照組仍較低(χ2=6.037，P=0.02)。見表1。

表1 各組大鼠血糖及注射APO后陰莖勃起的情況(±s)

表1 各組大鼠血糖及注射APO后陰莖勃起的情況(±s)

與對(duì)照組相比:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與模型組相比:3)P＜0.05，4)P＜0.01

?

2.3 各組大鼠血清睪酮濃度 模型治療組血清睪酮濃度〔(114.679 ± 30.12)nmol/L〕較 模 型 組 〔(16.253±2.452)nmol/L〕明顯增高(P＜0.01)，但明顯低于對(duì)照組〔(372.289±74.653)nmol/L〕(P ＜0.01)。

2.4 A-actin及Cx43 CJ蛋白表達(dá) 模型組A-actin，Cx43蛋白相對(duì)表達(dá)量最低(分別為15.96±2.3，16.43±3.3)。模型治療組兩種蛋白表達(dá)量明顯增加(分別為32.04±6.3，32.57±6.1)，仍明顯低于對(duì)照組(分別為52.01±5.9，50.99±6.4)(P＜0.05)。見圖1。

3 討論

全球已確診DM患者超過(guò)1.5億人，并呈每年遞增的趨勢(shì)〔6〕。ED是指持續(xù)或反復(fù)不能達(dá)到或維持足夠的陰莖勃起以完成滿意的性活動(dòng)，是DM的常見并發(fā)癥之一。而ED的男性患者中有約35%～75%是DM患者。目前利用STZ構(gòu)建的較為理想的DM ED大鼠模型，對(duì)于研究男科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域有著決定性的意義。STZ是一種含硝基的廣譜抗生素，對(duì)β細(xì)胞具有很強(qiáng)的殺傷作用，能夠誘導(dǎo)大鼠、小鼠、地鼠、犬、兔、猴等動(dòng)物產(chǎn)生DM。主要有兩方面的作用機(jī)制〔7〕:①誘導(dǎo)一氧化碳(NO)合成增加，增加了對(duì)胰島β細(xì)胞的氧化侵襲，與胰島素依賴型DM人發(fā)病機(jī)制相似;②小劑量注射STZ能夠破壞少量胰島細(xì)胞，巨噬細(xì)胞吞死亡胰島細(xì)胞，使TH1細(xì)胞系占優(yōu)勢(shì)而產(chǎn)生白細(xì)胞介素(IL)-2、干擾素(IFN)-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α 及NO等物質(zhì)，殺傷細(xì)胞，死亡細(xì)胞作為自身抗原，再次遞呈給巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞進(jìn)行處理，釋放大量細(xì)胞因子，形成級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)，增大細(xì)胞損傷效應(yīng)，最終導(dǎo)致胰島素依賴型 DM〔5〕。

目前雖然DM導(dǎo)致ED的直接原因還沒有明確的定論，有關(guān)因素包括血管性、神經(jīng)性、勃起組織病變性及內(nèi)分泌性等。

陰莖勃起是在神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)下陰莖動(dòng)脈及陰莖海綿體一系列血流動(dòng)力學(xué)變化的過(guò)程，陰莖組織擁有正常的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是完成這個(gè)過(guò)程的一個(gè)必要條件。而陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞在勃起過(guò)程中起到關(guān)鍵的作用，海綿體平滑肌張力的改變對(duì)勃起功能的重要影響已經(jīng)得到世界公認(rèn)〔8〕。在勃起過(guò)程中陰莖海綿體平滑肌的舒張使血流不斷流入陰莖海綿竇，海綿竇間隙不斷擴(kuò)大，陰莖腫脹，白膜受壓，引起溝通海綿竇與陰莖背靜脈的溝通靜脈受壓，限制了陰莖海綿體內(nèi)的血液流出，血管內(nèi)回流阻力上升，以至于靜脈血不能外流，陰莖內(nèi)血壓上升，最終產(chǎn)生了堅(jiān)硬的勃起〔8〕。因此任何有關(guān)影響海綿體平滑肌細(xì)胞的因素都可能導(dǎo)致ED的發(fā)生。睪酮能夠通過(guò)作用于陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞的雄激素受體維持其正常的細(xì)胞形態(tài)和功能。DM通過(guò)造成睪丸組織損傷、性腺分泌軸功能損傷等機(jī)制影響睪酮的合成與分泌等方式導(dǎo)致DM患者體內(nèi)的雄激素不足。A-actin是與海綿體平滑肌收縮功能密切相關(guān)的表型蛋白，其表達(dá)量的減少標(biāo)志著細(xì)胞由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化，海綿體平滑肌收縮功能明顯減弱，DM時(shí)其表達(dá)量明顯下降〔6，9〕。此外CJ有連接海綿體平滑肌細(xì)胞作為一個(gè)整體功能，對(duì)細(xì)胞的新陳代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、增殖及分化等生理過(guò)程起著極為重要的調(diào)控作用〔10〕。CX43是CJ表達(dá)量最多的蛋白通過(guò)電耦聯(lián)及代謝耦聯(lián)將眾多的陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞聯(lián)結(jié)成一功能性的整體，可協(xié)調(diào)諸多平滑肌細(xì)胞間的同步舒張，對(duì)誘導(dǎo)陰莖海綿體平滑的肌松弛與勃起的維持有重要的作用〔10〕。

本研究揭示DM性大鼠勃起功能與血清睪酮，海綿體平滑肌A-actin和CX43的水平密切相關(guān)，而胰島素治療對(duì)改善血清睪酮水平及海綿體平滑肌A-actin和CX43表達(dá)具有重要作用，但胰島素對(duì)ED治療作用的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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